干漿米線的變質(zhì)微生物及其污染源分析

蔣榮榮，王 洋，周幗萍

(武漢工業(yè)學(xué)院生物與制藥工程學(xué)院，湖北武漢430023)

米線是一種傳統(tǒng)食物，選用優(yōu)質(zhì)大米，經(jīng)發(fā)酵、磨漿、濾條、蒸粉、壓榨等工序制成的線狀食品，在我國(guó)具有悠久歷史。既可作為主食又可作為小吃，受到廣大消費(fèi)者特別是南方人的喜愛，也深受中外賓客的稱贊。米線品種甚多，吃法多樣，既可熱吃，也可涼吃，可葷可素，豐儉由人。

米線大致可分兩大類，一類是大米磨粉后直接放到機(jī)器中擠壓成型，靠摩擦的熱度使大米糊化成型，稱為“干漿米線”［1］。干漿米線曬干后即為“干米線”，方便攜帶、運(yùn)輸和貯藏，食用時(shí)，再蒸煮漲發(fā)。干漿米線筋骨硬，咬口，線長(zhǎng)，但缺乏大米的清香味。另一類是水米線［2］，較之干漿米線的制作工藝復(fù)雜得多。其傳統(tǒng)工序?yàn)榕菝住⒛{、澄濾、蒸粉、擠壓、煮制等。其生產(chǎn)周期長(zhǎng)，但口感滑潤(rùn)細(xì)膩，筋骨好，有大米的清香味，是傳統(tǒng)的制作方法。水米線中如大米經(jīng)過泡米、發(fā)酵后再磨漿制成的，俗稱“酸漿米線”，工藝更復(fù)雜，生產(chǎn)周期長(zhǎng)。

隨著我國(guó)人口流動(dòng)性的增加，米線這種南方特色食品在北方的發(fā)展趨勢(shì)也非常好。但是由于南北氣候、水質(zhì)的差異，迫使傳統(tǒng)的米線生產(chǎn)工藝必需做出調(diào)整。比如：北方不少地區(qū)水質(zhì)偏硬;另外，平均氣溫低，除夏季外，不適合發(fā)酵做酸漿米線;而水米線保質(zhì)期很短，一般是鮮食，不超過18 h［2］。所以要批量生產(chǎn)、運(yùn)輸、大量供應(yīng)門店的話，干漿米線是最合適的選擇。但干漿米線不同于粉絲等產(chǎn)品，其水分活度不夠低，當(dāng)夏季氣溫接近30℃時(shí)，容易長(zhǎng)霉，甚至在干燥后段，尚未出廠時(shí)，就能發(fā)現(xiàn)霉菌的白色菌絲。本研究是針對(duì)某企業(yè)提供的變質(zhì)干漿米線進(jìn)行污染微生物分析，探討其污染源頭，并在此基礎(chǔ)上對(duì)企業(yè)預(yù)防微生物引起的變質(zhì)提供參考意見。

1 材料與方法

1.1 樣品

2011年5月初某米線生產(chǎn)企業(yè)生產(chǎn)的變質(zhì)米線樣品4份。

1.2 質(zhì)控菌株

金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus ATCC 25923。

1.3 培養(yǎng)基

平板計(jì)數(shù)瓊脂(PCA，plate count agar);孟加拉紅培養(yǎng)基(虎紅培養(yǎng)基);Baird-Parker瓊脂平板;營(yíng)養(yǎng)瓊脂小斜面;腦心浸出液肉湯(BHI);兔血漿。

1.4 儀器設(shè)備

上海三申(YM50AI)全自動(dòng)滅菌鍋;蘇凈安泰SW-CJ-1FD無菌操作臺(tái);日本尼康Nikon 80i正置熒光相差顯微鏡。

1.5 實(shí)驗(yàn)方法

采用平板菌落計(jì)數(shù)法，分別在PCA和孟加拉紅(虎紅)培養(yǎng)基上進(jìn)行細(xì)菌總數(shù)和霉菌酵母總數(shù)的測(cè)定［3-4］。挑取單菌落分離、純化。細(xì)菌進(jìn)行單染色，油鏡觀察;霉菌進(jìn)行小培養(yǎng)，低倍鏡或高倍鏡下觀察產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)。以參考文獻(xiàn)［5］進(jìn)行初步鑒定。由細(xì)菌鏡檢結(jié)果，按照食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 4789.10—2010進(jìn)行金黃色葡萄球菌定性檢驗(yàn)［6］。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 樣品的污染微生物數(shù)量

對(duì)4份米線樣品的細(xì)菌總數(shù)和霉菌總數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)，結(jié)果見表1。

表1 樣品的平板菌落計(jì)數(shù)的結(jié)果/cfu·g-1

2.2 污染細(xì)菌的初步鑒定

四份送檢樣品的污染細(xì)菌數(shù)量非常高，均為白色、淺黃、金黃色圓形菌落，菌落邊緣光滑。每平板上挑選數(shù)個(gè)菌落，做單染色、觀察。發(fā)現(xiàn)盡管菌落顏色不同，但顯微形態(tài)基本一致。在Baird-Parker平板上菌落直徑為1—2 mm，顏色呈灰色到黑色，有的菌落周圍為一混濁帶，但在其外層均無透明圈。可初步鑒定到葡萄球菌屬Staphylococcus spp.(圖1)。分離菌株均為血漿凝固酶陰性。

圖1 葡萄球菌屬菌株的顯微形態(tài)

2.3 污染真菌的初步鑒定

4份樣品的污染真菌中以霉菌為主，只檢出少量酵母。因酵母本身的安全性較好，所以重點(diǎn)分析霉菌種類。從各個(gè)平板上的菌落情況來看主要有5種真菌：

F1：菌落呈絨毛狀，扁平，為黑色，反面為黑色。菌絲暗色，有隔膜。分生孢子深褐色，呈紡錘狀，頂端延長(zhǎng)成喙?fàn)睿嗉?xì)胞，有壁磚狀分隔，分生孢子數(shù)個(gè)成鏈。鑒定為交鏈孢霉Alternaria spp.［7］(圖2)。

圖2 F1交鏈孢霉的顯微形態(tài)

F2：菌落初(1—2 d時(shí))為白色短絨狀，3—4 d中心變綠，老熟后，變深綠，帶黃色。該菌具較發(fā)達(dá)的帚狀枝，數(shù)十個(gè)分生孢子串生形成長(zhǎng)鏈，鑒定為擬青霉 Paecilomyces spp.［8］(圖3)。

圖3 F2擬青霉的顯微形態(tài)

F3：菌落疏松，菌絲細(xì)長(zhǎng)、灰色絮狀，生長(zhǎng)迅速，培養(yǎng)一天就可見菌落，基質(zhì)黑色，反面深灰色;菌絲無隔，未見假根和匍匐菌絲，菌絲體上直接長(zhǎng)出軸狀分支的孢囊梗，各分枝頂端著生球形孢子囊。鑒定為毛霉Mucor spp.(圖4)。

圖4 F3毛霉的顯微形態(tài)

F4：生長(zhǎng)較快，培養(yǎng)2 d后，菌落生白色醭，毛絨狀，韌或者易碎，菌落直徑7mm，4 d后直徑25—35 mm。菌落白色，絨毛狀，扁平，均勻，有同心圈，有的中心突起。菌絲有隔，菌絲成熟后斷裂成成鏈、長(zhǎng)筒形、末端鈍圓的節(jié)孢子。鑒定為白地霉Geotrichum candidum［7］(圖5)。

圖5 F4白地霉的顯微形態(tài)

F5：菌落紅色或者粉紅色，突起，有光澤，邊緣整齊。鏡檢為橢圓形、芽殖的酵母(圖6)。

圖6 F5酵母的顯微形態(tài)

這5種真菌在樣品中的檢出情況詳見表2。

表2 5種真菌在樣品中的檢出情況 /cfu·g-1

正常干漿米線保質(zhì)期只有2—3 d。送來的四份米線樣品本來有米線粘結(jié)、肉眼發(fā)現(xiàn)有長(zhǎng)霉或產(chǎn)氣等變質(zhì)樣品，加上郵寄、檢測(cè)時(shí)間，所以四份樣品的微生物數(shù)量非常高，細(xì)菌總數(shù)在106—108cfu/g，霉菌數(shù)量在103—104cfu/g。但是微生物的組成菌相不會(huì)發(fā)生重大轉(zhuǎn)變。從微生物組成來看，霉菌主要是擬青霉、毛霉、白地霉和交鏈孢霉。而細(xì)菌則主要是葡萄球菌屬。

3 討論

該廠較重視生產(chǎn)車間的衛(wèi)生，車間內(nèi)衛(wèi)生條件較好，有風(fēng)淋設(shè)備，工作人員都有專用手套、帽子和工作服，米線的干燥車間內(nèi)還配置了紫外燈進(jìn)行空氣和表面殺菌。盡管如此，春夏之交，氣溫在25℃以上就出現(xiàn)了比例相當(dāng)高的變質(zhì)產(chǎn)品，部分米線在干燥車間出來，尚未包裝、出廠時(shí)就有肉眼可見的白色菌絲。

原料大米中會(huì)存在一定種類和數(shù)量的微生物［9］。其中細(xì)菌生長(zhǎng)需要較高水分，只有在糧食霉變后期相對(duì)濕度達(dá)100%出現(xiàn)游離水的情況下才開始參與活動(dòng)。酵母菌常為糧食的附生微生物，它對(duì)大米的害處極為有限。而霉菌能分泌出活性很強(qiáng)的酶系，分解糧食的有機(jī)物質(zhì)，生長(zhǎng)繁殖快，對(duì)儲(chǔ)糧大米危害極大。危害最為嚴(yán)重又普遍的是曲霉和青霉［10］。

檢測(cè)結(jié)果中，米線主要污染細(xì)菌為葡萄球菌，為凝固酶陰性。血漿凝固酶是鑒別葡萄球菌有無致病性的重要指標(biāo)。其中，凝固酶陰性葡萄球菌(Coagulase-negative Staphylococci，CNS)，其廣泛分布于自然界，到1991年該菌至少有30種，是最常見的條件致病菌。該菌存在于健康人皮膚、腔及腸道的正常菌，因其不產(chǎn)生血漿凝固酶等毒性物質(zhì)，被認(rèn)為無致病作用。近年來臨床及實(shí)驗(yàn)室研究證明，CNS是醫(yī)院內(nèi)感染的重要病原菌，是創(chuàng)傷、尿道、中樞經(jīng)系統(tǒng)感染和敗血癥的常見病原菌［11］，以表皮葡萄球菌和溶血葡萄球菌居多［11-13］，且其耐藥菌株比金黃色葡萄球菌更為多見，已日益受到重視。CNS致病機(jī)制主要與細(xì)菌胞壁外的胞外多粘質(zhì)物質(zhì)(Extracellanar slime substance，ESS)有關(guān)［14］，ESS 由細(xì)菌分泌并粘附在細(xì)菌菌體外表面。菌體被ESS包繞后，容易使細(xì)菌在感染部位定居，并能保護(hù)細(xì)菌抵御宿主的免疫應(yīng)答作用，阻斷或減弱抗菌素的滲透;在細(xì)菌粘附、抗吞噬和抵抗宿主的免疫防御中有重要的致病作用。最近研究表明，該菌體生物膜的形成是致病機(jī)制的一個(gè)重要致病因素，經(jīng)常導(dǎo)致持續(xù)感染。且該菌能夠耐受相當(dāng)高濃度的抗生素，其抗生素耐藥機(jī)制與傳統(tǒng)的不同，至今仍未清楚生物膜是如何耐藥的［15］。

從微生物的種類和數(shù)量上看，細(xì)菌污染很可能來自磨粉和擠壓成型階段，在干燥、運(yùn)輸過程中生長(zhǎng)繁殖。雖然葡萄球菌多數(shù)來自人體體表，但考慮到該廠已經(jīng)配備了風(fēng)淋設(shè)備、手套和帽子，還應(yīng)考慮是否是食品加工設(shè)備帶來的污染。葡萄球菌具有很好的生物膜形成能力，對(duì)熱、干燥的耐受性比其他無芽孢細(xì)菌強(qiáng)，近年來耐藥性增強(qiáng)，對(duì)多種抗菌藥物不敏感;其可能通過加工設(shè)備帶來持續(xù)污染。從多份樣品都能檢出葡萄球菌，而且在細(xì)菌數(shù)量中占有絕對(duì)優(yōu)勢(shì)中可見一斑。

米線樣品中污染真菌具有空氣中真菌的典型菌相。污染霉菌主要為青霉、毛霉和交鏈孢霉等，它們常見于土壤和空氣中。其中青霉孢子耐熱性強(qiáng)，常引起食物霉變。白地霉是一種類酵母狀的真菌，廣泛分布在自然界中轉(zhuǎn)化力強(qiáng)，繁殖速度快，能利用多種有機(jī)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)行腐生生活;屬于條件致病菌，有關(guān)白地霉病的臨床資料，并不多［16］。原料大米在糊化成型過程中的高溫起到一定殺菌作用，但是來自后續(xù)冷卻、晾干、包裝過程中帶來的空氣真菌污染更大。因?yàn)楦稍锕に嚥扇〉目販馗稍铮菬犸L(fēng)干燥，所以干燥過程較長(zhǎng)，溫度和濕度比較適合霉菌的生長(zhǎng)造成。盡管干燥車間有配備了紫外燈，由于米線是密集地掛在車間內(nèi)的，紫外線只對(duì)能照射的區(qū)域有殺菌作用，另外生成的臭氧也有殺菌作用，但明顯殺菌力不足。

傳統(tǒng)的酸漿米線因?yàn)橛邪l(fā)酵階段，微生物消耗了易利用的小分子營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)發(fā)酵產(chǎn)酸，pH值較低，抑制了微生物的繁殖，所以不僅口感好，安全性也較好。普通水米線含水量非常高、pH近中性，微生物容易超標(biāo)，所以一般只能鮮食。干漿米線雖然經(jīng)過干燥，但是水分活度還不夠低，真菌能夠生長(zhǎng)，細(xì)菌中葡萄球菌也能在其中繁殖導(dǎo)致超標(biāo)。葡萄球菌屬微生物中金黃色葡萄球菌能產(chǎn)耐熱的毒素，經(jīng)常導(dǎo)致葡萄球菌腸毒素食物中毒，對(duì)食品安全危害很大。

本研究提示我們想把傳統(tǒng)食品—米線做大做強(qiáng)，在保鮮、干燥工藝上還有需要深入研究的地方。

［1］ 李里特，成明華.米粉的生產(chǎn)與研究現(xiàn)狀［J］. 食品與機(jī)械，2000，(3)：29-31.

［2］ 傅曉如.保鮮濕米粉及制作工藝［J］.食品工業(yè)，2000，(5)：9-10.

［3］ GB 4789.2—2010，食品微生物學(xué)檢驗(yàn)：菌落總數(shù)測(cè)定［S］.

［4］ GB 4789.15—2010，食品微生物學(xué)檢驗(yàn)：霉菌和酵母計(jì)數(shù)［S］.

［5］ 東秀珠，蔡妙英.常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)［M］.北京：科學(xué)出版社，2001.

［6］ GB 4789.10—2010，食品微生物學(xué)檢驗(yàn)：金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)［S］.

［7］ 中國(guó)科學(xué)院微生物研究所《常見與常用真菌》編寫組.常見與常用真菌［M］.北京：科學(xué)出版社，1973.

［8］ 孔華忠.中國(guó)真菌志第三十五卷-青霉屬及其相關(guān)有性型屬［M］.北京：科學(xué)出版社，2007.

［9］ 賈珍珍，杜學(xué)勤，賀玉梅，等.北京市售大米霉菌污染情況調(diào)查分析［J］.中國(guó)公共衛(wèi)生，1987，6(5)：265-267.

［10］ 李榮濤.糧食微生物與糧食防霉［J］.墾殖與稻作，2004(3)：52-53.

［11］ 陳益明，陳文淑，楊紹佑，等.凝固酶陰性葡萄球菌感染類型與耐藥性調(diào)查［J］.浙江檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)，2005，3(3)：30-31.

［12］ 張揚(yáng)，楊風(fēng)霞，楊守磊，等.577株凝固酶陰性葡萄球菌重新鑒定及耐藥性分析［J］.泰山衛(wèi)生，2001，25(1)：6-9.

［13］ Maria de Lourdes RS Cunha，Yuri K Sinzato，Liciana VA Silveira.Comparison of methods for the identification of coagulase-negative staphylococci［J］.Memórias do Instituto Oswaldo Cruz，2004，99(8)：855-860.

［14］ Mark H Wilcox，Paul Williams，David G E Smith，et al.Variation in the expression of cell envelope proteins of coagulase-negative staphylococci cultured under iron-restricted conditions in human peritoneal dialysate［J］.Journal of Microbiology，1991，137，2561-2570.

［15］ Nuno Cerca，Silvia Martins，F(xiàn)ilipe Cerca，et al.Comparative assessment of antibiotic susceptibility of coagulase-negative staphylococci in biofilm versus planktonic culture as assessed by bacterial enumeration or rapid XTT colorimetry［J］.The Journal of Antimicrobial Chemotherapy，2005 Aug;56(2)：331-336.

［16］ 劉自強(qiáng).白地霉的研究近況［J］.揚(yáng)州大學(xué)學(xué)報(bào)(農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版)，1980(4)：49-54.