響應曲面法優化小麥淀粉制備麥芽糖漿糖化工藝的研究

亢潘潘，胡秋林

(武漢工業學院食品科學與工程學院，湖北武漢430023)

麥芽糖漿生產中常用的糖化酶制劑主要有以下三種［1-2］：(1)β-淀粉酶即麥芽糖酶，屬于外切酶，可進一步水解淀粉、糊精分子，依次切開相隔的α-1、4鍵，生成麥芽糖。雖隨著酶用量的增加或是延長糖化時間可以增加麥芽糖的生成量，但是由于β-淀粉酶無法水解或繞過支鏈淀粉(小麥淀粉中含有75%-81%的支鏈淀粉、25%-19%的直鏈淀粉的α-1、6糖苷鍵，而生成 β-極限糊精)［3］。(2)真菌 α-淀粉酶，屬于內切淀粉酶，能分解α-1，4葡萄糖苷鍵，不能水解α-1，6鍵，但可繞過繼續水解。水解產物除了麥芽糖外，還有部分葡萄糖和較多的麥芽三糖及α-限制糊精。α-限制糊精的相對分子量遠比β-限制糊精小，故制成的麥芽糖漿粘度低而有良好的流動性，有利于后期過濾等精制。(3)普魯蘭酶，脫支酶的一種，催化分解支鏈淀粉和糊精中的α-1，6-D-葡糖鍵產生包含α-1，4鍵的線性低聚糖。通常與糖化酶或是β-淀粉酶共同作用生產結晶葡萄糖和高麥芽糖漿。

本實驗利用酸-酶聯用液化小麥淀粉得到DE值為8.12%的液化液。以此液化液為基礎進行糖化的研究。液化液以短鏈糊精為主，同樣含有一定數量的α-1、4葡萄糖、少量麥芽糖、低聚糖及部分淀粉等［4］。在糖化過程中選擇 β-淀粉酶與真菌 α-淀粉酶協同糖化液化液，單因素試驗以DE值為參考優選出各因素較好值，再以響應面分析方法進行更優化試驗并以HPLC檢測麥芽糖產率參考。為以小麥淀粉為原料生產麥芽糖漿的工業生產提供了理論依據，也為下一步對小麥淀粉糖化液的精制奠定了理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

小麥淀粉：實驗室自制;β-淀粉酶：上海源葉生物科技有限公司;真菌α-淀粉酶：天津諾奧科技發展有限公司;甲醇 色譜級;乙醇 色譜級;超純水;麥芽糖標準品Dr.Ehrenstorfer純度99.6%：上海安譜科學儀器有限公司。

1.2 儀器設備

可見分光光度計(V1100型)，上海美譜達儀器有限公司;酸度計(FE20)，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;電熱恒溫水浴鍋(HHS型)，上海博訊實業有限公司醫療器械制造廠;低速離心機(LD5-10(Ⅲ)型)，北京醫用離心廠;循環水式真空泵(SHZ-D型)，河南鞏義市英峪予華儀器廠;磁力加熱攪拌器(78-1型)，國華電器有限公司;集熱式恒溫加熱磁力攪拌器(DF-1015型)，河南鞏義市英峪予華儀器廠;真空冷凍器(Free Zone 2.5型)，LABC once生產廠;液相色譜儀 waters R401示差檢測器;色譜柱 waters 5μm KR100-5NH2，φ250mm ×4.6mm。

1.3 試驗方法

1.3.1 工藝流程

小麥淀粉酸-酶液化，復合酶協同糖化的工藝流程見圖1。

圖1 小麥淀粉酸-酶液化復合酶糖化工藝流程示意圖

1.3.2 操作要點

小麥淀粉加水調成30%料液比的淀粉乳，加入5%的無機酸鹽酸12 mL，100℃，加熱酸化12 min，堿中和后酸調節pH值至5.4，在64℃，8 mL濃度為0.0143 g/100 mL的中溫 α-淀粉酶，酶解 30 min，恒溫水浴鍋中100℃，保持10 min進行滅酶，所得液化液的DE值為8.12%。在此液化液基礎上，加濃度為0.133 g/100 mL、適量的β-淀粉酶、濃度為0.4 g/100 mL、適量的真菌 α-淀粉酶協同糖化，調節 pH至5.3［5］，置于集熱式恒溫加熱磁力攪拌器中55℃加熱一定時間，置于100℃水浴，保溫10min滅酶，取一定量糖化液以DE值變化情況為衡量指標，采用響應曲面法確定并分析最佳糖化條件;將最佳條件下的酶解糖化液于-50℃冰箱中冷凍48 h后放入溫度-56℃，真空度為1.6 Pa的真空冷凍器中進行冷凍干燥制粉，稱取一定量的糖化干燥粉溶解于一定比例的流動相中，利用高效液相色譜法測定麥芽糖含量。

1.4 分析方法

1.4.1 β-淀粉酶活力測定

分光光度計法

1.4.2 真菌α-淀粉酶活力測定

QB 2526-2001硫代硫酸鈉溶液滴定法。

1.4.3 pH值

GB/T 20885-2007中6.4酸度計測定。

1.4.4 DE值測定

GB/T5009.7-2003直接滴定法。

1.4.5 麥芽糖含量測定

采用GB/T 20883-2007高效液相色譜法。

高效液相色譜的分析條件：

檢測器：示差檢測器，waters R401;

色譜柱：KR100-5NH25 μm，φ 250 mm ×4.6 mm;

分析條件：柱溫：30℃;

流動相：乙醇∶水=80∶20;

流速：1μL/min;

進樣量：20 μL。

1.5 糖化試驗設計方案

1.5.1 響應面試驗設計方案

湖北省位于中國地勢第二級階梯向第三級階梯過渡地帶，地勢呈三面高起、中間低平、向南敞開、北有缺口的不完整盆地，山地、丘陵、崗地和平原兼備。全省雖地處典型的亞熱帶季風區內，但也緊靠秦淮氣候分割線。因此，湖北省既大部分為亞熱帶季風性濕潤氣候區，同時降水地域分布呈由南向北遞減趨勢明顯，且時空分布不均。受地形地貌及降水影響，加之河湖眾多、水網密布的實際情況，湖北省既得水之利、近水獨優，又受制于水、因水而憂，全省水災旱災呈易發多發趨勢。盡管湖北省建成的防洪、排澇、灌溉、供水工程體系有效緩解了這一癥狀，但在水利工程保障薄弱地區以及部分水資源過度開發地區，仍不同程度的存在。

根據單因素試驗結果：糖化時間、β-淀粉酶的添加量及真菌α-淀粉酶的添加量對DE值的影響較其它因素更加明顯，因此，設糖化時間(A)、β-淀粉酶的添加量(B)、真菌α-淀粉酶的添加量(C)三個因素為變量，以糖化液DE值為響應值(Y)進行響應曲面分析，設計三因素三水平的實驗，優化小麥淀粉糖化工藝。因素水平設計如表1所示。

表1 試驗因素與水平的選取

1.5.2 響應曲面數據分析方法

響應曲面分析方法可以利用較少的實驗數據推算達到目標值的優化條件，而響應曲面分析圖可反映各參數之間的互相作用［6-7］。利用Design Expert 7.1.6軟件中的Box-Behnken Design模型，對糖化時間(A)、β-淀粉酶的添加量(B)、真菌 α-淀粉酶的添加量(C)三個因素進行響應面分析，并對所得的響應面回歸模型進行顯著性檢驗。

2 結果與分析

2.1 響應面數學模型構建與分析

以單因素確定的條件：糖化溫度為55℃，pH 5.3、濃度為0.133 g/100 mL的 β-淀粉酶、濃度為0.4g/100 mL的真菌α-淀粉酶協同糖化為實驗前提條件，對小麥淀粉糖化時的糖化時間(A)、β-淀粉酶的添加量(B)、真菌α-淀粉酶的添加量(C)三個因素為變量，進行三因素三水平的試驗研究。以糖化液DE值為響應值(Y)進行響應曲面分析，優化小麥淀粉糖化工藝。測得試驗結果如表2所示。

表2 響應曲面分析試驗結果與預測結果

利用Design Expert軟件對表2數據進行二次多元回歸擬合，得到小麥淀粉糖化液DE值(Y)對編碼自變量糖化時間(A)、β-淀粉酶添加量(B)、真菌α-淀粉酶添加量(C)的二次多項回歸方程：

Y=102.10+4.32A+1.65B-1.62C+0.96AB-2.27AC-1.68BC-11.71A2-11.51B2-7.19C2

式中：

A——糖化時間/h;

B——β-淀粉酶添加量/mL;

C——真菌 α-淀粉酶添加量/mL。

從該模型的方差分析表3可見，本試驗所選的二次多項模型具有高度的顯著性(P=0.0001)，失擬項不顯著，其回歸模型的校正決定系數為0.9352，說明該模型能解釋93.52%的變化，相關系數(r)為0.9716，表明小麥淀粉糖化液DE值的實測值與預測值之間具有較好的擬合優度，對實踐具有指導意義。

由表3可見，3個試驗因素對小麥淀粉糖化液DE值的曲面效應皆顯著;線性影響效應中因素糖化時間較β-淀粉酶添加量、真菌α-淀粉酶兩個因素顯著。

表3 回歸方程系數及其顯著性檢驗

2.2 響應面等高線分析結果

通過二次多項回歸方程所做的響應曲面圖及其等高線圖見圖2—圖7。響應面顯示糖化時間和β-淀粉酶添加量、糖化時間和真菌α-淀粉酶、β-淀粉酶和真菌α-淀粉酶的交互作用對小麥淀粉糖化液DE值的影響。

圖2 糖化時間和β-淀粉酶添加量響應面3D圖

圖3 糖化時間和β-淀粉酶添加量等高線圖

圖2和圖3顯示了在固定真菌α-淀粉酶添加量10 mL時，小麥淀粉糖化時間和β-淀粉酶添加量對糖化液DE值的交互影響效應。由圖3可以直觀地看出在糖化時間在30—39 h的區域內，糖化液DE值隨著β-淀粉酶的添加量的增加而增加;而當糖化時間在39—42 h的區域內，隨著β-淀粉酶的添加量的增加，糖化液的DE值反而下降。

圖4 糖化時間和真菌α-淀粉酶添加量響應面3D圖

圖5 糖化時間和真菌α-淀粉酶添加量等高線圖

圖4和圖5顯示了在固定了β-淀粉酶添加量為10 mL時，小麥淀粉糖化時間和真菌α-淀粉酶添加量對糖化液DE值的交互影響效應。由圖5可以直觀地看出，在糖化時間在30—39 h的區域內，隨著真菌α-淀粉酶添加量的增加，糖化液DE值增加;而糖化時間在39—42 h的區域內，隨著真菌α-淀粉酶添加量的增加，糖化液DE值反而下降。

圖6 β-淀粉酶添加量和真菌α-淀粉酶添加量響應曲面3D圖

圖7 β-淀粉酶添加量和真菌α-淀粉酶添加量等高線圖

圖6和圖7顯示了在固定糖化時間為36 h時，β-淀粉酶添加量和真菌 α-淀粉酶添加量對糖化液DE值的交互影響效應。由圖7可以直觀地看出，在β-淀粉酶添加量在7—10 mL的區域內，糖化液DE值隨著真菌α-淀粉酶的添加量的增加而增加;而β-淀粉酶添加量在10—13 mL的區域內，隨著β-淀粉酶的添加量的增加，糖化液的DE值反而下降。

對響應曲面圖2—圖7綜合分析可以看出：試驗最佳條件應在等高線(DE值)98.8附近，比較6組圖可知，糖化時間是影響小麥淀粉糖化液糖化的最顯著因素，表現為等高曲線陡峭;β-淀粉酶添加量次之;真菌α-淀粉酶添加量對糖化液DE值影響最小，表現為等高線較為平緩，說明此因素對響應值影響較其他兩種因素較小。

2.3 響應面數學模型尋優與模型驗證

為了驗證小麥淀粉糖化工藝模型方程的合理性和有效性，通過對此模型的二次多項數學模型解逆矩［8-9］，小麥淀粉糖化最佳工藝參數為：糖化時間37.22 h，β-淀粉酶添加量 10.28 mL，真菌 α-淀粉酶添加量為9.53 mL，預測DE值為102.74%。

驗證性實驗結果如下表4所示：當糖化時間取值為37.30 h，β-淀粉酶添加量取值為10 mL，真菌α-淀粉酶添加量取值為9.5 mL，實際DE值為103.32%。與預測值非常接近，可以判斷三元二次多項式回歸模型可以應用于后期研究。

表4 響應面數學模型尋優結果

小麥淀粉在最佳的液化和糖化工藝條件下，制備小麥淀粉糖化液，測得 DE值后將糖化液經48h，-50℃冰箱中冷凍后放入溫度 -56℃，真空度為1.6 Pa的真空冷凍器中進行冷凍干燥制粉，稱取一定量的糖化干燥粉溶解于80%乙醇中制成糖漿，利用高效液相色譜檢測，結果如圖8所示。

圖8 麥芽糖漿的HPLC圖

圖8是麥芽糖漿的高效液相色譜圖，7.848 min前出現的是溶劑峰及死峰，7.848 min出現的是葡萄糖峰，9.732 min出現的是麥芽糖峰，12.304 min出現的是麥芽三糖，9.732 min后出現的是分子量大于麥芽三糖的大分子糖類物質的峰［10］。從圖8中的峰面積大小可以看出麥芽糖在此糖漿中含量較大。通過麥芽糖的液相標準曲線和回歸方程計算可得，麥芽糖的含量為62.1%。

3 結束語

本實驗采用單因素試驗和Box-Behnken設計方法，對糖化時間、β-淀粉酶、真菌α-淀粉酶兩種糖化酶協同作用小麥淀粉制備麥芽糖的工藝條件進行優化。利用統計學建立DE值(Y)對編碼糖化時間(A)、β-淀粉酶的添加量(B)、真菌 α-淀粉酶的添加量(C)的二次多項數學模型：

Y=102.10+4.32A+1.65B-1.62C+0.96AB-2.27AC-1.68BC-11.71A2-11.51B2-7.19C2.

3個試驗因素對小麥淀粉糖化液DE值的曲面效應皆顯著;線性影響效應中糖化時間(A)、β-淀粉酶的添加量(B)、真菌α-淀粉酶的添加量(C)均顯著。通過對模型方程3-D圖及其等高線圖進行分析，獲得了影響小麥淀粉糖化液DE值的最佳工藝條件，利用模型方程對DE值的趨勢進行預測，再通過驗證試驗證明最佳實際的工藝條件為糖化時間為37.30 h，β-淀粉酶添加量為10 mL，真菌 α-淀粉酶添加量為9.5 mL，實際最大的DE值為103.32%。利用高效液相色譜法檢測得出麥芽糖的含量為62.1%。本實驗研究對小麥淀粉糖化工藝提供主要的參數，可為對比實驗研究奠定基礎。

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