氣導聽覺剝奪幼鼠螺旋神經節NSE表達

王楓謝寧田建偉朱曉全武軍

(1.空軍總醫院，100142；2.空軍航空醫學研究所附屬醫院，100089；3.空軍工程大學機要系，100097)

研究發現，多種動物的感覺系統在發育的過程中都有一個關鍵時期，在這個時期內，去除或者改變傳入神經沖動對中樞神經系統的結構和功能可以產生極大的影響[1-3]。聽覺剝奪效應(auditory deprivation effect)是1996年由15位著名聽力學家組成的Eriksholm工作組討論提出，并定義為由于聲學信息的減少導致的聽覺功能的逐漸下降[4]。在現實生活中，越來越多的耳科醫生注意到聽覺剝奪對耳病患者的聽覺產生了不良影響，包括聽閾的提高和言語識別率的降低。大腦發生聽覺剝奪效應后產生的解剖生理學改變，目前的研究都是通過動物實驗間接獲得。耳蝸切除是常用的聽覺剝奪動物模型的造模方法，因其破壞了耳蝸毛細胞的完整性，不能通過聽覺電生理的方法檢測動物的聽功能，同時使得對聽覺傳導通路的起始部位——螺旋器(Corti器)的研究無法進行。我們選擇幼年動物進行氣導聽覺剝奪，一方面減少發育關鍵期聽覺系統聲音信號的輸入，另一方面保持耳蝸的正常結構，目的在于獲得聽覺剝奪對聽覺系統中螺旋神經節發育的影響結果。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 實驗動物采用清潔級SD乳鼠60只，雌雄不限，由第四軍醫大學動物實驗中心提供。

1.1.2 試劑 兔抗神經元特異性烯醇化酶 (neuronal specific enolase，NSE)多克隆抗體、SABC試劑盒購自武漢博士德公司。

1.1.3 儀器 聽覺電生理檢測儀(Biologic，Traveler Express E，USA)。冰凍切片機(德國LEICA CM1850)。

1.2 方法

1.2.1 動物分組 實驗動物隨機分為對照組和AD(Auditary Deprivation)組。AD組大鼠飼養于密閉隔音室，生后12 d起行耳道填塞至生后42 d；對照組大鼠正常食水、在正常聲音環境中飼養。

1.2.2 模型制備 采用文獻[5]方法進行耳道填塞(圖1)。

1.2.3 腦干誘發電位(ABR)檢測 采用聽覺電生理檢測儀(Biologic，Traveler Express E，USA)于出生后42 d分別對對照組、AD組大鼠進行ABR檢測。

將實驗動物以2％戊巴比妥鈉100 mg/kg行腹腔注射麻醉。記錄電極刺入矢狀縫與兩外耳道連線交點頭皮下，參考電極放置在刺激耳后皮下，接地電極放置在大鼠尾根部皮下。交替短聲刺激，聲源距外耳孔1.0 cm，刺激間隔為0.1 ms，濾波帶通為100～2 000 Hz，掃描時間為10 ms，疊加次數為512次。大鼠ABR共有5個波，其中以Ⅱ、Ⅲ波為主，以剛剛出現可以辨認的Ⅱ或Ⅲ波為標準，記錄ABR聽閾值，并分別記錄潛伏期和交替短聲刺激后幅值。測試在雙層屏蔽室內進行，環境噪聲≤40 dB SPL。測試時注意對動物保溫。

1.2.4 免疫組織化學染色

1.2.4.1 冰凍切片標本制備 于出生后42 d分別進行AD組和對照組大鼠耳蝸冰凍切片。實驗動物如前法麻醉，4％多聚甲醛心內灌流固定，斷頭，取聽泡置4％多聚甲醛后固定過夜。10％EDTA脫鈣，30％蔗糖脫水至沉底，OCT包埋，冰凍切片機連續切片，層厚10μm。

1.2.4.2 螺旋神經節NSE染色及神經元計數 一抗為兔抗NSE多克隆抗體，濃度為1∶300，二抗為生物素標記的羊抗兔二抗。DAB顯色，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。光學顯微鏡下觀察，照相。陰性對照以PBS代替一抗。

每張切片選取耳蝸第二轉螺旋神經節、隨機取60個高倍視野進行細胞計數。

1.3 統計學方法 數據以均數±標準差 (x±s)表示，應用SPSS 13.0統計軟件進行統計學處理，組間差異應用t檢驗，P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 ABR閾值及潛伏期比較 氣導聽覺剝奪至出生后42 d，對照組及AD組大鼠的ABR閾值分別為 (26.67±3.89)dB SPL和(38.18±5.54)dB SPL，經統計學分析P＜0.01，差異有高度統計學意義。對照組和AD組Ⅰ波到Ⅴ波各波潛伏期統計結果P＞0.05，差異無統計學意義；對照組和AD組Ⅰ波到Ⅴ波各波幅值統計結果Ⅱ波、Ⅲ波、Ⅴ波幅值P＜0.05，差異有統計學意義(表1～2，圖2～3)。

2.2 兩組大鼠腦干傳導時間比較 ABR各波中Ⅴ波最為穩定，且振幅最高。波Ⅰ～Ⅴ間期也稱為腦干傳導時間或中樞傳遞時間。AD組與對照組波Ⅰ～Ⅴ間期比較，對照組為(3.978±0.435)ms，AD組為(3.629±0.616)ms，P＜0.001，差異有高度統計學意義。

2.3 螺旋神經節神經元NSE染色神經元形態及計數比較對照組大鼠螺旋神經節神經元NSE染色顯示正常神經元NSE主要存在于胞漿，胞體著色明顯，核著色略淺淡，胞體排列有一定密度，不能從形態上區分兩型神經元。胞體發出的神經纖維著色較胞體略淺。AD組大鼠免疫組化顯示神經元顯色較對照組明顯變淺，形態模糊，排列紊亂，神經纖維著色基本正常(圖4)。

神經元計數結果對照組為(10.643±1.104)個/HP，AD組為(7.883±0.987)個/HP，兩組比較，P＜0.05，差異有統計學意義。

圖1 SD大鼠氣導聽覺剝奪方法

圖2 ABR各波潛伏期

圖3 ABR各波幅值

圖4 螺旋神經節NSE免疫組織化學染色

表1 ABR各波潛伏期(m s)(n＝30，x±s)

表2 ABR各波幅值(μV)(n＝30，x±s)

3 討論

人們早已發現，改變嗅覺、視覺和聽覺系統中感覺輸入信號會影響相應系統神經網絡在形態和功能上的發育與成熟[1-3]。有研究證實聽覺剝奪可以延緩大鼠上外橄欖核(LSO)神經元抑制性突觸的發育。Sanes等發現，破壞出生后1周大鼠的耳蝸將導致與抑制性突觸相關的、軸索和樹突正常的形態學再變構過程的阻斷[6]。通過破壞幼年砂鼠單側耳蝸以阻斷聲輸入則可以阻斷LSO神經元抑制性突觸和樹突的形態發育[7]。目前的研究觀察到聽覺剝奪導致耳蝸螺旋神經節細胞發生退行性變，這可能歸因于聲刺激的減少。在完全缺乏聲刺激(耳蝸毀損)較聽覺剝奪對螺旋神經節細胞的影響更為明顯[8]。大鼠生后發育“關鍵期”一般認為從第12天開始，到第30天結束[9-10]，我們選擇在生后12～42 d對大鼠進行聽覺剝奪，目的在于減少發育關鍵期聽覺系統聲音信號的輸入，希望從相反方向證明正常的聲音刺激對螺旋神經節發育的促進作用。

ABR檢測結果顯示，AD組與對照組比較，聽閾值升高約10 dB，ABR波幅降低，P＜0.05，差異有統計學意義；兩組大鼠ABR各波幅值比較，Ⅱ波、Ⅲ波、Ⅴ波幅值的差異有統計學意義，P＜0.05。ABR檢測中，Ⅰ波是辨認其他各波的基準，尤為重要。波Ⅴ常是最高的峰，改變給聲重復率和降低聲強，對波Ⅴ的出現率影響較少，在其他波消失后，波Ⅴ還繼續存在。而峰間期中尤以Ⅰ～Ⅴ間期最為重要。因此，我們在計算了各波的幅值和潛伏期后，對Ⅰ～Ⅴ間期也進行了統計學分析，AD組與對照組相比，P＜0.01，差異顯著。AD組較對照組Ⅱ波、Ⅲ波、Ⅴ波幅值降低，說明其各自來源部位耳蝸核、上橄欖核、下丘功能受到影響。以上結果可以證實，氣導聽覺剝奪對動物的聽覺功能造成了損害，進而可以推測其對聽覺傳導通路的相關部位產生了不良影響。

烯醇化酶是1934年Lohman和Mayerhof在研究肌肉提取物中磷酸甘油酸向丙酮酸轉化的過程中發現的。烯醇化酶是糖酵解途徑中的關鍵酶，普遍存在于生物體的糖酵解代謝中，它既可催化糖酵解過程中2-磷酸-D-甘油酸(PGA)向磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)的轉化，又可在糖原合成過程中催化逆向反應，即作為磷酸丙酮酸水合酶，使PEP向PGA轉化，在細胞能量代謝中起重要作用[11]。在脊椎動物中，烯醇化酶存在3種同工酶：α、β、γ[12]。α、β、γ烯醇化酶分別由3種不同的基因所編碼，所有的烯醇化酶活性形式均為二聚體，即由兩個亞單位組成，目前已知有5種形式的組合：αα、ββ、γγ、αβ、αγ[13]。神經元特異性烯醇化酶(NSE)主要分布于神經元和神經內分泌細胞的胞漿中。周圍神經中NSE含量遠低于腦組織，相差10～100倍。在我們的觀察中，AD組螺旋神經節神經元NSE染色著色變淺，ABR聽閾較對照組明顯提高，這可能是由于神經傳入信號的減少誘導了NSE基因表達的下調，繼發細胞能量代謝障礙，影響神經元細胞內正常糖酵解過程，使三磷酸腺苷減少，干擾神經元的正常功能所致。

聽覺的產生和傳導是一個復雜的過程，是聽覺感受器和聽覺傳導通路共同作用產生的結果，在這個復雜的過程中，很難說聽覺剝奪對聽覺系統發育關鍵期的哪個部位產生了影響，很有可能多個部位同時受累，具體的結果還有待于今后的深入研究。

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