重癥監護病房碳青霉烯類抗生素耐藥鮑曼不動桿菌耐藥機制及同源性分析

毛 璞， 邱桂霞， 葉 丹， 劉曉青， 黎毅敏，

重癥監護病房碳青霉烯類抗生素耐藥鮑曼不動桿菌耐藥機制及同源性分析

毛 璞， 邱桂霞＊， 葉 丹， 劉曉青＊＊， 黎毅敏＊，＊＊

目的分析耐碳青霉烯類抗生素鮑曼不動桿菌基因型，進行同源性分析，探討碳青霉烯類抗生素耐藥率升高的原因。方法應用WHONET 5.0分析廣州醫學院第一附屬醫院重癥監護病房（ICU）分離的鮑曼不動桿菌耐藥率變化。收集2008年1月至2009年12月ICU碳青霉烯類抗生素耐藥鮑曼不動桿菌35株，應用VITEK-2全自動細菌鑒定儀進行菌株鑒定，采用K-B紙片擴散法測定15種抗菌藥物的敏感性，PCR檢測金屬β內酰胺酶及碳青霉烯酶OXA基因，脈沖場凝膠電泳（PFGE）分析同源性。結果該院分離的鮑曼不動桿菌對碳青霉烯類抗生素的耐藥率顯著增加，對美羅培南的耐藥率從10.8%升高到62.3%，對亞胺培南的耐藥率從13.5%升高到58.8%。PFGE分析存在8個克隆；blaOXA-51、blaOXA-23、blaOXA-58陽性的分別為33株（94.3%）、20株（57.1%）和6株（17.1%）。ISAba1相關blaOXA-23是碳青霉烯酶主要的存在形式。未檢測到金屬β內酰胺酶。結論該院ICU分離的鮑曼不動桿菌OXA-23型碳青霉烯酶基因檢出率最高，并存在交叉感染的情況，應引起臨床重視。

鮑曼不動桿菌； 碳青霉烯酶； 脈沖場凝膠電泳

鮑曼不動桿菌已成為引起醫院感染的最主要的細菌之一［1-2］。對產超廣譜β內酰胺酶（extendedspectrumβ-lactamases，ESBLs）、Amp Cβ內酰胺酶（AmpCβ-lactamases，AmpC酶）的鮑曼不動桿菌引起的重癥感染，碳青霉烯類抗生素是最后一道防線。碳青霉烯類抗生素耐藥的分子機制主要由于外源性獲得碳青霉烯酶，主要分為B類和D類酶。B類酶又 稱 為 金 屬 β 內 酰 胺 酶 （metallo-β-lactamases，MBLs），目前鮑曼不動桿菌中已被鑒別出來的獲得性MBLs有IMP、VIM型酶等。D類酶為苯唑西林酶（OXA型酶），在鮑曼不動桿菌中常見有blaOXA-23、blaOXA-24、blaOXA-51、blaOXA-58［3］。此 外，常 見插入序列ISAba1位于OXA基因前增強其表達［4］。

2008—2009年間，我院重癥監護病房（ICU）分離的鮑曼不動桿菌對碳青霉烯類抗生素耐藥率明顯升高。本研究主要通過對 MBLs、OXA、ISAba1等基因的檢測，分析該菌對碳青霉烯類抗生素耐藥的變化，從而探討其對碳青霉烯類抗生素耐藥機制。

材料與方法

一、材料

（一）菌株來源 2008年1月至2009年12月，我院ICU住院患者痰標本臨床分離株，非重復臨床分離的碳青霉烯類抗生素耐藥鮑曼不動桿菌（carbapenem-resistantAcinetobacterbaumannii，CRAB）35株。

（二）儀器與試劑 PCR擴增儀（Bio-rad公司1000），凝膠成像系統（Bio-rad公司）。所用引物均由上海英駿生物技術有限公司合成。PCR試劑購自大連寶生物工程有限公司。New England Biolabs限制性內切酶ApaⅠ。

二、方法

（一）菌株鑒定及藥敏試驗 使用VITEK-2微生物自動檢測儀鑒定菌種。采用K-B紙片擴散法測定鮑曼不動桿菌對哌拉西林、哌拉西林-他唑巴坦、替卡西林-克拉維酸、頭孢他啶、頭孢噻肟、頭孢吡肟、頭孢曲松、亞胺培南、美羅培南、阿米卡星、慶大霉素、米諾環素、環丙沙星、左氧氟沙星和甲氧芐啶-磺胺甲口惡唑等15種抗菌藥物的敏感性，以大腸埃希菌ATCC 25922、銅綠假單胞菌ATCC 27853和金葡菌ATCC 25923為質控菌株，結果判定參照CLSI 2009年標準。

（二）脈沖場凝膠電泳（PFGE） 分離株接種于LB液體培養基中，37℃培養過液。離心收集40 μLA540的菌液，20μL 1×TE重懸，加入等體積的2%cleancut agarose（Bio-rad，USA）。立即混勻后加入模具，制成膠塊。將膠塊放入300μL的細胞裂解液（100 mmol／L Tris、100 mmol／L EDTA），加入20 mg／m L的蛋白酶K 5μL 50℃浴過夜。去掉細胞裂解液，加入800μL 1×TE洗3次，每次1 h。0.1×TE 800μL洗1 h。繼續酶切或放4℃保存備用。每塊小膠加50 u ApaⅠ（NEB，USA）內切酶，25℃過夜。CHEF-DR Ⅲ脈沖場電泳儀（Bio-rad，USA），0.5×TBE，1%Pulsed Field Certified Agarose（Bio-rad），14℃，6V／cm，角度變換120°，線性，轉換時間為0.5～20 s，時間20 h。電流結束后，EB染色后成像。

應用Bio Numerics軟件行圖像分析，選擇UPGMA（unweighted pair group method using arithmetic averages）方法，條帶位置差異容許度1%，優化值0.5%，相似度≥80%為同一亞型，代表同一克隆株；＜80%者為不同的基因型，代表不同的克隆株［5］。

（三）PCR檢測 應用煮沸法粗制細菌DNA模版。PCR 檢 測blaIMP-1、blaIMP-2、blaVIM-1、blaVIM-2、blaOXA-23、blaOXA-24、blaOXA-51、blaOXA-58基 因，各 基 因 引物序列、目的產物長度和退火溫度見表1。PCR體系總體積50μL，10×緩沖液 5μL，d NTPs 200μmol／L，上下游引物各400 nmol／L，Taq聚合酶1.25 u，DNA模板1μL。擴增產物取5μL進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，90 V，30 min。EB染色后成像。PCR產物送上海英駿生物技術有限公司測序。

結 果

一、藥敏試驗結果

應用WHONET5.4分析2008年1月至2009年12月ICU分離鮑曼不動桿菌的耐藥率，碳青霉烯類抗生素的耐藥率顯著增加，對美羅培南的耐藥率從10.8%增加至62.3%，對亞胺培南的耐藥率從13.5%增加至58.8%（圖1）。

二、碳青霉烯酶基因及插入序列檢測

2008年1月至2009年12月，我院重癥監護病房住院患者痰標本臨床分離非重復CRAB共51株，由于屬于回顧性分析，將其中隨機凍存的35株進一步分析。

在35 株 CRAB 中，blaOXA-51、blaOXA-23、blaOXA-58陽性的分別為33株（94.3%）、20株（57.1%）和6株（17.1%）。同時攜帶blaOXA-51和blaOXA-23菌株有20株（57.1%）；同時攜帶blaOXA-51和blaOXA-58的菌株有 6 株 （17.14%）。 未 檢 測 出blaOXA-24、blaIMP-1、blaIMP-2、blaVIM-1、blaVIM-2基 因。攜 帶 有blaOXA-23的 菌株上游檢測均檢測到插入序列ISAba1，5株菌株blaOXA-51上游檢測到ISAba1，1株菌株blaOXA-58上游檢測到ISAba1。

表1 碳青霉烯酶基因及插入序列PCR引物Table1.Primers and insert sequences used in polymerase chain reaction to detect carbapenemase genes

圖1 2008年至2009年鮑曼不動桿菌耐藥率變化FIG.1.Changing pattern of antibiotic resistance in the A.baumannii strains isolated during the period from 2008 through 2009

三、PFGE同源性分析

采用PFGE對CRAB進行同源性分析，結果顯示共存在8個克隆，克隆A包括2110、1566菌株，克隆B包括4006、3038菌株，克隆C包括4128、2544、4358菌株，克隆 D包括3605、2772、3334，克隆 E包括3693、3325，克隆F包括685、4492，克隆G包括4026、4405，克隆H包括433、1239（見圖2）。上述結果提示在研究期間存在6次交叉感染（分別涉及2例患者）；存在2次小規模流行，分別涉及3例患者。51.4%（18／35）分離出CRAB的患者發生了交叉感染。

討 論

近年來，鮑曼不動桿菌在全球的擴散引起了極大的關注。自1985年碳青霉烯類抗生素應用于臨床，該菌對其耐藥率逐年增加。對CRAB大多數為多重耐藥菌，因此對住院患者造成的威脅也逐年增大。另由于ICU患者病情重，侵襲性操作多，成為多重耐藥細菌滋生傳播的主要場所［6］。因此，本研究對ICU臨床分離CRAB進行耐藥趨勢、同源性及耐藥分子特征分析，研究鮑曼不動桿菌對碳青霉烯類抗生素耐藥的變化與 MBLs、OXA、ISAba1的相關性，探討鮑曼不動桿菌迅速擴散的原因。

圖2 PFGE圖譜及系統樹狀圖FIG.2.PFGE profiles of Apa-I digested genomic DNA of 35 carbapenem-resistant A.baumannii strains isolated from ICU patients

OXA-23是鮑曼不動桿菌中最早報道的OXA型碳青霉烯酶［7］。本研究結果顯示本組CRAB OXA-23的攜帶率為57.1%，為主要分布的碳青霉烯酶，此陽性率明顯低于其他醫院或地區的報道；本研究中OXA-58的陽性率為17.1%，卻明顯高于其他醫院或地區的報道。沈萍等［8］報道2005年浙江地區CRAB的OXA-23陽性率已經高達94.15%（322／342），無 OXA-58的檢測出；四川大學華西醫院2006至2009年ICU CRAB的OXA-23陽性率已經高達 99.0% （98／97），OXA-58 陽性率 僅 為1%［9］；全國12所三級甲等醫院2007年7月至2008年6月 CRAB 的 OXA-23陽性率為80.4%（78／97），OXA-58陽性率僅為2.1%［10］。此期間內廣州地區相關研究鮮有報道。因此我們推測可能由于地域、科室等不同，存在不同的流行菌株，造成了OXA-23、OXA-58陽性率的差異。盡管 OXA-23、OXA-58陽性率在上述報道中各有高低，但OXA-23均為鮑曼不動桿菌中主要分布碳青霉烯酶的型。

35株CRAB中33株菌攜帶OXA-51基因，僅有5株菌的上游存在ISAba1，6株OXA-58陽性菌株中1株菌上游檢測到ISAba1，20株OXA-23陽性菌株上游均檢測到ISAba1。上述結果表明在我院分離的CRAB中ISAba1主要位于OXA-23的上游。

同時攜帶OXA-51和OXA-23的20株菌中，ISAba1均位于OXA-23的上游；同時攜帶blaOXA-51和blaOXA-58的菌株有6株（17.1%），僅有1株菌的OXA-58上游存在ISAba1，其余菌株blaOXA-51和blaOXA-58上游均未檢測到ISAba1。當OXA-23與 OXA-51或 OXA-58同時存在，ISAba1傾向插入OXA-23的上游。因此，我們推測，菌株一旦外源獲得OXA-23基因，ISAba1從其他位置轉移優先插入至OXA-23的上游。

本研究中，2株菌沒有檢測出鮑曼不動桿菌固有耐藥基因OXA-51，我們推測這2株菌可能不是鮑曼不動桿菌，而屬于其他不動桿菌；或可能OXA-51的基因發生變異，PCR無法檢測。

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The resistance mechanism and molecular epidemiology of carbapenem-resistantAcinetobacterbaumanniiin an intensive care unit

MAOPu，QIUGuixia，YEDan，LIUXiaoqing，LIYimin. （DepartmentofInfectionControl，The FirstAffiliatedHospitalofGuangzhouMedicalCollege，Guangzhou510120，China）

ObjectiveTo analyze the carbapenemase genotypes and homogeneity among the isolates ofAcinetobacterbaumannii，and identify the factors contributing to the increasing carbapenem resistance.MethodsWHONET 5.0 software was used to analyze the changing prevalence of antibiotic resistance.Thirty-five carbapenem-resistantA.baumanniiisolates were collected from an Intensive Care Unit between 2008 and 2009.All strains were identified by VITEK-2 and tested by Kirby-Bauer disk diffusion test.The carbapenemases and their relationship with ISAba1，metallo-β-lactamases genes were analyzed by PCR.Genotyping were conducted by pulsed-field gel electrophoresis.ResultsThe prevalence of meropenem-resistant strains increased rapidly from 10.8%to 62.3%，and imipenem-resistant strains increased from 13.5%to 58.8%.Eight clones were identified in the 35A.baumanniistrains.TheblaOXA-51，blaOXA-23，andblaOXA-58genes were identified in 94.29% （33／35），57.14% （20／35）and 17.14% （6／35）of theseA.baumanniistrains，respectively.ISAba1-associatedblaOXA-23genes were prevalent in carbapenem-resistantA.baumannii.No metallo-β-lactamases gene was identified.ConclusionsOXA-type carbapenemases（mainly OXA-23）play an important role in carbapenem-resistantA.baumannii.Attention should be paid to the cross-infection and prevalence of carbapenem-resistantA.baumanniiin ICU.

Acinetobacterbaumannii； carbapenemase； pulsed-field gel electrophoresis

黎毅敏，E-mail：lymin98＠yahoo.com。

R978.12；R378

A

1009-7708（2012）06-0449-04

廣州市教育局創新團隊科研基金（B94117）；廣州市科技計劃項目（2010J-E171）。

廣州醫學院第一附屬醫院醫院感染管理部，廣州 510120；＊呼吸疾病國家重點實驗室 廣州呼吸疾病研究所；＊＊重癥醫學科。

毛璞（1981—），女，助理研究員，博士，主要從事醫院感染控制與細菌耐藥研究。

2012-06-01

·論著·