硫酸小諾霉素注射液無菌檢查方法的建立及驗證

楊 昊， 朱曉玥， 錢文靜

(江蘇省食品藥品檢驗所，江蘇南京210009)

硫酸小諾霉素(micronomicin sulfate)為第3代氨基糖苷類抗生素，具有快速殺菌和抑菌能力，不易產生耐藥性，且注射時不需進行皮試，具有療效好、副作用小、價格較低等特點［1］。該藥原料和注射液已被多版《中國藥典》和日本藥局方收載［2-3］。

為確保臨床用藥安全，需對硫酸小諾霉素注射劑進行無菌檢查。但對具有抗菌活性的注射劑進行無菌檢查時需選擇適宜的方法消除其抗菌作用，以保證檢查結果的準確性和可靠性。例如，采用薄膜過濾法對硫酸小諾霉素進行無菌檢查時即可用適量0.1%無菌蛋白胨氯化鈉水溶液沖洗，從而在保證所有陽性對照菌正常生長的前提下，檢查染菌情況。由此可見，沖洗液的沖洗量和敏感菌的選擇對具有抗菌活性的注射劑的無菌檢查至關重要:沖洗量過少時，不能消除抗生素的抑菌作用，因而會出現陽性對照菌不生長的現象，從而導致漏檢，但沖洗量過大，則可能使膜的通透性增加，或損傷菌體，同樣也會導致漏檢，因此，應在保證消除抑菌作用的情況下，選用盡量少的沖洗量;而選擇恰當的敏感菌不但可簡化實驗步驟，還可避免假陰性，提高染菌的檢出率。然而，《中國藥典》對沖洗量及敏感菌的選擇尚無具體規定。為此，筆者按《中國藥典》2010年版二部附錄ⅪH“無菌檢查法”中的原則性要求進行試驗，確定了硫酸小諾霉素注射劑無菌檢查的具體條件，彌補了檢驗標準的不足。

1 材料

1.1 儀器

HTY-2000A型智能集菌儀(泵速設為160 r· min－1，杭州泰林生物技術設備有限公司)，配全封閉三聯集菌培養器(杭州泰林生物技術設備有限公司);隔水式恒溫培養箱(上海博訊實業有限公司醫療設備廠)。

1.2 藥品

硫酸小諾霉素注射液，規格為2mL∶60mg(6萬單位)，批號為1103312、1103082和1102141，由江西制藥有限責任公司提供。

1.3 培養基和試劑

硫乙醇酸鹽流體培養基(批號:110419)，改良馬丁培養基(批號:1104192)，營養瓊脂培養基(批號:101013)，營養肉湯培養基(批號:101112)，改良馬丁瓊脂培養基(批號:100818)，均由北京三藥科技開發有限公司提供。0.9%無菌氯化鈉溶液和0.1%無菌蛋白胨氯化鈉溶液，均按照《中國藥典》2010年版二部附錄ⅪH“無菌檢查法”項下要求配制及滅菌。

1.4 菌種

金葡菌(Staphylococcus aureus)［CMCC(B)26 003］，枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)［CMCC(B)63 501］，大腸埃希菌(Escherichia coli)［CMCC(B)44 102］，生孢梭菌(Clostridium sporogenes)［CMCC(B) 64 941］，白色念珠菌(Candida albicans)［CMCC(F) 98 001］，黑曲霉(Aspergillus niger)［CMCC(F)98 003］，均由中國藥品生物制品檢定所提供。

2 方法與結果

2.1 供試菌液的制備

接種金葡菌、大腸埃希菌和枯草芽孢桿菌的新鮮培養物至10 mL營養肉湯培養基中，接種生孢梭菌的新鮮培養物至10 mL硫乙醇酸鹽流體培養基中，35℃培養20 h，取這4種培養物，用0.9%無菌氯化鈉溶液制成含菌數小于100 cfu·mL－1的菌懸液，用營養瓊脂培養基平板計數;接種白色念珠菌的新鮮培養物至10 mL改良馬丁培養基中，25℃培養24 h，取培養物，用0.9%無菌氯化鈉溶液制成含菌數小于100 cfu·mL－1的菌懸液，用改良馬丁瓊脂培養基平板計數;接種黑曲霉的新鮮培養物至10 mL改良馬丁瓊脂培養基上，25℃培養5 d，加0.9%無菌氯化鈉溶液4 mL將孢子洗脫，取洗脫液，用0.9%無菌氯化鈉溶液稀釋至含孢子數小于100 cfu·m L－1的孢子懸液，用改良馬丁瓊脂培養基平板計數(見表1)。

表1 供試菌液的計數Table1 The count of tested bacteria liquid

根據《中國藥典》2010年版二部附錄ⅪH“無菌檢查法”規定，上述菌液所含菌(孢子)數均小于100 cfu·mL－1，可作為工作菌液使用。

2.2 培養基適用性檢查

取每管裝量為12 mL的硫乙醇酸鹽流體培養基9支，分別用“2.1”項下制備的金葡菌、大腸埃希菌、枯草芽胞桿菌和生孢梭菌菌懸液各接種2支，每支接種量為1 mL，余下1支不接種，作為細菌空白對照;取每管裝量為9 mL的改良馬丁培養基5支，分別用“2.1”項下制備的白色念珠菌和黑曲霉菌菌懸液各接種2支，每支接種量為1 mL，余下1支不接種，作為真菌空白對照;將各支培養基置規定溫度下(細菌35℃，真菌25℃，以下同)培養14 d，逐日記錄觀察結果(見表2)。由表2可見，加菌后的培養基上呈現菌落生長，空白對照培養基上無菌生長。表明無菌檢查用的硫乙醇酸鹽流體培養基及改良馬丁培養基符合培養基的無菌性檢查及靈敏度檢查的要求。

表2 培養基適用性檢查結果Table2 Results of the examination for the applicability ofmedium

2.3 無菌檢查方法驗證

2.3.1 試驗組無菌檢查 取一次性全封閉三聯集菌培養器，用少量0.9%無菌氯化鈉溶液潤濕濾膜;取硫酸小諾霉素注射液60支，轉移至300 mL的0.9%無菌氯化鈉溶液中，搖勻，全量通過集菌培養器，隨后用0.1%無菌蛋白胨氯化鈉溶液沖洗，每次每筒注入沖洗液100 mL［2］，充分振搖，蕩洗筒壁，完全排空后再循環操作，在最后一次的沖洗液中分別加入金葡菌、大腸埃希菌和枯草芽孢桿菌菌懸液，菌落數為10～100 cfu(每筒加1種菌)，再向3個筒內各注入硫乙醇酸鹽流體培養基100 mL;另取本品60支，同法操作，在最后一次的沖洗液中分別加入生孢梭菌、白色念珠菌和黑曲霉菌菌懸液，菌落數為10～100 cfu(每筒加1種菌)，然后向加入生孢梭菌菌液的筒內注入硫乙醇酸鹽流體培養基，加入白色念珠菌和黑曲霉菌菌液的筒內注入改良馬丁培養基，注入量均為100 mL;將各培養基置規定溫度下，培養3～5 d，逐日觀察，記錄沖洗量分別為每筒100 mL和每筒200 mL(即每筒沖洗2次)時各培養基上菌落生長情況。重復做3批，結果見表3。

表3 各試驗菌的驗證結果Table3 Results of the bacteria validation

2.3.2 陽性對照組無菌檢查 取一次性全封閉三聯集菌培養器，不加供試品，按照“2.3.1”項下方法進行沖洗，共得6筒，在最后一次沖洗液中分別加入金葡菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌、生孢梭菌、白色念珠菌和黑曲霉菌菌懸液，菌落數為10～100 cfu (每筒加 1種菌)，再分別注入相應的培養基100 mL，作為陽性對照。將各培養基置規定溫度下培養3～5 d，逐日觀察，記錄沖洗量分別為每筒100 mL和每筒200 mL時各培養基上菌落生長情況，結果見表3。

2.3.3 陰性對照組無菌檢查 取一次性全封閉三聯集菌培養器，過濾300 mL的0.9%無菌氯化鈉溶液和100 mL的0.1%無菌蛋白胨氯化鈉水溶液，然后分別注入硫乙醇酸鹽流體培養基和改良馬丁培養基各100 mL，作為陰性對照。將各培養基置規定溫度下，培養3～5 d，逐日觀察，記錄0.1%無菌蛋白胨氯化鈉水溶液用量為每筒100 mL和每筒200 mL時各培養基上菌落生長情況，結果見表3。

2.4 供試品的無菌檢查

取本品(批號:1103312)60支，轉移至300 mL的0.9%無菌氯化鈉溶液中，搖勻，全量通過全封閉三聯集菌培養器，用0.1%無菌蛋白胨氯化鈉水溶液沖洗，每筒沖洗2次，每次100 mL;第2次沖洗后，2筒注入硫乙醇酸鹽流體培養基各100 mL(其中1筒接入大腸埃希菌作為陽性對照)，1筒注入改良馬丁培養基100 mL。另取一套全封閉過濾器，過濾300 mL的0.9%無菌氯化鈉溶液和200 mL的0.1%無菌蛋白胨氯化鈉水溶液，然后分別注入硫乙醇酸鹽流體培養基和改良馬丁培養基各100 mL，作為陰性對照。將各培養基置規定溫度，培養14 d，逐日觀察(見表4)。由表4可見，供試品組和陰性對照組澄清，陽性對照菌則生長良好。表明供試品無菌檢查符合規定。

表4 供試品無菌檢查結果Table4 Results of the sterility test

3 討論

在對無菌檢查方法進行驗證時發現，當沖洗量為100 mL時，試驗組所有黑曲霉和白色念珠菌均能生長，表明硫酸小諾霉素對真菌的抑菌作用弱于對細菌的抑制作用，而大腸埃希菌生長情況不良，表明沖洗量為每筒100 mL時不能消除抗生素的抑菌作用;當沖洗量增加到每筒200 mL時，所有菌均生長良好，表明在該沖洗條件下可消除硫酸小諾霉素的抑菌作用，故在對供試品進行無菌檢查時將沖洗量定為每筒200 mL。由表3可知，生長情況最差的菌株為大腸埃希菌，故選用大腸埃希菌作為硫酸小諾霉素的敏感菌株。據此，本文建立了以大腸埃希菌作為敏感菌、采用0.1%無菌蛋白胨氯化鈉水溶液沖洗2次(每次100 mL)的薄膜過濾法作為硫酸小諾霉素注射液無菌檢查方法。

［1］李暉，康秉學，賀浪沖.小諾霉素臨床研究進展［J］.西北藥學雜志，1995，10(6):267-269.

［2］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(二部)［M］.北京:化學工業出版社，2010:960.

［3］Society of Japanese Association of Law Books.The Japanese Pharmacopoeia［M］.15th ed.Tokyo:Society of Japanese Pharmacopoeia，2006:893.