遼五味子黃酮純化及定性光譜分析

馬 濤， 毛紅燕， 石太淵， 張睿

（1.遼寧省農業科學院 食品與加工研究所，遼寧 沈陽 110161；2.沈陽農業大學 食品學院，遼寧 沈陽 110161）

遼五味子黃酮純化及定性光譜分析

馬 濤1，2， 毛紅燕2， 石太淵1， 張睿1

（1.遼寧省農業科學院 食品與加工研究所，遼寧 沈陽 110161；2.沈陽農業大學 食品學院，遼寧 沈陽 110161）

選用4種大孔樹脂對遼五味子黃酮進行了靜態吸附與解吸附試驗。結果表明，HZ－818型樹脂對黃酮的吸附率可達76.24%，解吸率達到67.30%，與其他4種型號樹脂相比最適宜于遼五味子黃酮的分離純化。通過對HZ－818樹脂動態吸附試驗，確定黃酮加樣質量濃度為1.6 mg／m L時，上樣體積為65 m L，上樣流量1 m L／min，洗脫流量1.5 m L／min，用體積分數70%的乙醇進行洗脫，洗脫液用量為110 m L，可達到較好的洗脫效果，洗脫率可達到79.57%。提取物經光譜分析，證實為黃酮類化合物。

遼五味子；黃酮；大孔吸附樹脂；光譜分析

遼五味子（LiaoSchisandrachinensis），木蘭科植物也稱為“北五味子”，主產地為我國遼寧省，是藥食同源功能性保健食品［1］。目前，我國對遼五味子的化學成分研究比較深入，已報道的有木脂素、三萜、倍半萜、有機酸、揮發油及多糖等成分［2－4］。但是，關于遼五味子含黃酮的研究尚未見報道。

大孔吸附樹脂是一類吸附分離材料，由于其自身具有多孔結構，可根據空隙大小對化學成分進行機械篩分，同時又帶有極性基團，可通過范德華力和形成氫鍵對極性相近的化學成分進行選擇性吸附［5］。它不溶于酸、堿及各種有機溶劑且有較好吸附性能的有機高聚物吸附劑，近年來逐漸被應用于中草藥化學成分的提取、分離、純化和中藥新藥的開發研制［6－7］。為更好地開發利用遼五味子黃酮類物質，作者采用大孔樹脂對遼五味子黃酮進行純化及定性分析，為遼五味子的合理利用提供一定的科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 試驗材料遼五味子：購于遼寧省桓仁縣；試驗用水均為蒸餾水；蘆丁標準品：中國藥品生物制品檢定所產品；AB－8、HZ－818、NKA－9、D－101大孔吸附樹脂：安徽三星樹脂有限公司產品；亞硝酸鈉、硝酸鋁、無水乙醇、氫氧化鈉、石油醚（60～90℃）：均為分析純。

1.1.2 試驗儀器DHL－A電腦恒流泵：上海滬西分析儀器廠產品；DBS－160電腦全自動部分收集器：上海滬西分析儀器廠產品；DZF－6050型真空干燥箱：上海一恒科技有限公司產品；JY92－Ⅱ超聲波細胞粉碎機：寧波新芝生物科技股份有限公司產品；XA－1型固體樣品粉碎機：河南省鞏義市光壓儀器廠產品；7200型可見分光光度計：尤尼柯（上海）有限公司產品；TDL－5000B型離心機：上海安亭科學儀器廠產品；Avatar 330傅立葉紅外分光光度計：美國Thermo Nicolet公司產品。

1.2 方法

1.2.1 遼五味子黃酮的提取遼五味子果實→低溫下烘干（50℃）→粉碎機粉碎→過篩→按1 g∶25 m L的料液質量體積比加體積分數65%的乙醇溶劑浸潤→超聲處理（300 W，15 min）→離心→提取液旋轉蒸發揮去乙醇，濃縮→石油醚脫脂→旋轉蒸發揮去石油醚→待純化黃酮液

1.2.2 黃酮含量測定AlCl3比色法［8］。

1.2.3 樹脂的預處理與再生用體積分數95%乙醇浸泡48 h，充分溶脹后用蒸餾水洗至無醇，用質量分數5%氫氧化鈉溶液浸泡12 h，蒸餾水洗至中性，再用質量分數5%鹽酸溶液浸泡12 h，用蒸餾水洗至中性，備用。

1.2.4 靜態試驗

1）靜態吸附量考察［9］用濾紙吸干預處理好的樹脂表面的水分后，準確稱取1.0 g，置于250 m L具塞磨口三角瓶中，加入黃酮質量濃度為1.6 mg／m L的遼五味子黃酮的待純化液30 m L，25℃下，置于搖床（150 r／min）振蕩12 h，然后靜置12 h使其充分吸附，平行3份，測定此時溶液中的總黃酮的含量，按照下式計算吸附量（Q）、吸附率（A）。

式中：Q為吸附量（mg／g）；C0為起始質量濃度（mg／m L）；Cr為剩余質量濃度（mg／m L）；V為溶液體積（m L）；W為樹脂質量（g）；A為吸附率。

2）靜態解吸性能考察 將上述已吸附飽和的大孔吸附樹脂濾出，用濾紙吸干藥液 （用蒸餾水清洗至樹脂表面無黃酮溶液殘留），置于250 mL錐形瓶中，精確加入體積分數70%乙醇30 mL，置于搖床（150 r／min）振蕩12 h，然后靜置12 h，濾液進行含量測定，平行3份，測出吸收度值并計算靜態解吸附率。

式中：D為解吸率；Q為吸附量（mg／g）；Cr為解吸后溶液中總黃酮的質量濃度（mg／m L）；W為樹脂干重（g）。

3）靜態吸附動力學曲線的繪制 分別準確稱取1.0 g預處理好的樹脂，置于250 m L三角瓶中，各加入30 m L遼五味子黃酮待純化液（黃酮質量濃度為1.6 mg／m L），25℃下振搖（150 r／min）12 h，每隔1 h移取0.1 m L上清液，用體積分數80%乙醇定容至10 m L，測定其黃酮含量，繪制靜態吸附動力學曲線。

1.2.5 動態試驗通過靜態試驗，選擇出一種較優的樹脂，對上樣量、上樣流速、洗脫液濃度、解析流速、洗脫體積進行動態吸附實驗。將預處理好的樹脂濕法裝入（D1.6 cm×30 cm）玻璃層析柱中，大孔吸附樹脂充分自然沉降，使填裝高度為柱高的2／3。將黃酮提取液上柱，待樣品溶液全部通過樹脂柱后用4BV的去離子水洗至流出液無色，用不同體積分數的乙醇以一定洗脫速度洗脫，收集洗脫液。通過測定總黃酮含量考察各因素對樹脂吸附性能的影響，確定最佳吸附工藝條件。

1.2.6 定性光譜分析

1）紫外測定 分光光度計法：亞硝酸鈉，硝酸鋁顯色法。

2）紅外測定 KBr壓片法。

2 結果與分析

2.1 遼五味子黃酮的純化

2.1.1 大孔吸附樹脂的選擇4種大孔樹脂預處理后，對遼五味子黃酮的靜態吸附及解析實驗，測得各種樹脂對黃酮的吸附與解吸結果見表1。結果表明，樹脂 HZ－818吸附黃酮效果最好，其次是NKA－9樹脂，黃酮吸附量都在35 mg／g以上。每種樹脂對黃酮的解吸結果分析表明，HZ－818樹脂的黃酮解吸率較大，而NKA－9雖然吸附率較大，但是解吸較困難。

表1 不同樹脂對五味子黃酮的吸附與解吸結果Tab.1 Adsorption capabilities and desorption rates of Liao Schisandra chinensis（Turcz.）Baill flavones

僅用樹脂的平衡吸附量和解吸率來評價其吸附性能是不全面的，合適的樹脂不僅要具有較大的吸附量、良好的解吸率，同時應具有較快的吸附速率，所以我們又研究了其靜態吸附動力學特征。圖1為3種樹脂的靜態吸附動力學曲線。

圖1 大孔樹脂靜態吸附動力學曲線Fig.1 Static－adsorption dynamic curve of macroporous resins

由圖1可知，HZ－818樹脂對遼五味子黃酮的吸附為快速平衡型，起始階段吸附量較大，5 h已基本接近吸附平衡，而NKA－9種樹脂起始吸附量雖較大，但到達平衡的時間較長，10 h后才基本接近吸附平衡，D－101樹脂吸附量相對較少。結合樹脂對遼五味子黃酮的吸附與解吸附效果，選擇HZ－818樹脂進行動態吸附試驗。

2.1.2 動態吸附－解析試驗結果

1）上樣流量及上樣量的確定 通過調節恒流泵的流量對上柱樣液進行吸附流量的選擇，以泄漏點最遲出現的吸附流量為宜［10］。

圖2 吸附流量與吸光度關系圖Fig.2 Relationship between adsorption velocity and absorbance

在上樣質量濃度均為1.591 mg／m L，樣液體積均為80 m L的條件下，控制流量分別進行動態吸附試驗。5種吸附流速下的泄漏情況如圖2所示。由計算可知，流量為0.5、1、1.5、2.0、2.5 m L／min時，泄漏點依次為71，67，50，43，40 m L。流量為0.5 m L／min時，雖然滲漏點出現的最遲，但因為流速慢，導致循環周期延長，工作效率低。而進樣速度為1 m L／min時，泄漏點盡管出現得稍早，但工作效率高于0.5 m L／min。其它條件下泄漏點出現的太早，吸附效率低，而且在試驗過程中發現，速度過快容易導致進樣管堵塞。因此上樣流量定為1 m L／min，上樣量為65 m L。

2）洗脫液體積分數的確定 不同體積分數的乙醇極性不同，對黃酮的洗脫能力也不同。取已處理好的大孔吸附樹脂柱，將待純化液以1 m L／min流速上樣，上樣量為65 m L。用5 BV蒸餾水洗脫，除去蛋白質和多糖，然后依次用6 BV體積分數10%、30%、50%、70%和90%的乙醇梯度洗脫，流量定為2 m L／min，測定各部分洗脫液中總黃酮的含量，計算各部分解吸率。結果如圖3所示，用體積分數70%乙醇洗脫時不僅能將大部分黃酮洗脫下來，而且最節省乙醇用量。

圖3 不同洗脫劑體積分數對黃酮純化的影響Fig.3 Effect of the concentration of ethanol on Purifieation

3）洗脫液流量的影響 洗脫液流量直接影響大孔吸附樹脂對總黃酮的洗脫效果。流量過大容易形成拖尾現象且洗脫不徹底，過小則生產周期明顯延長，成本增加。試驗采用吸附黃酮后的樹脂柱以體積分數70%的乙醇為洗脫液，洗脫流量分別對應0.5、1、1.5、2.0、2.5 m L／min。對解析效果作比較，結果如圖4所示。

圖4 不同解吸流量與吸光度的關系Fig.4 Relationship between desorption velocity and absorbance

由圖4可以看出，以1.5 m L／min的流量進行洗脫得到的峰形沒有明顯拖尾現象，洗脫時間最短，效率最高，而2.0 m L／min和2.5 m L／min的洗脫峰比1.5 m L／min的峰形寬且拖尾比較嚴重，表明洗脫不徹底，效率較低。1.0 m L／min雖然洗脫率于1.5 m L／min時相當，但是洗脫時的峰拖尾嚴重，洗脫時間明顯延長，效率低下，不利于生產。因此選擇解析流量為1.5 m L／min為宜。

4）洗脫液用量的確定 吸附黃酮后的樹脂柱以體積分數70%的乙醇為洗脫液，洗脫流量控制為1.5 m L／min。用部分收集器收集洗脫液，6 m L／管，測定其吸光度，結果如圖5所示。

圖5 不同洗脫劑用量對異黃酮純化的影響Fig.5 Effect of the dosage of ethanol on Purification

由圖5可知，隨著洗脫液用量的增加，洗脫液中黃酮質量濃度逐漸增加，第10管洗脫液中黃酮質量濃度最高。隨著洗脫時間的延長，隨后各部分洗脫液中異黃酮質量濃度逐漸減少，至第19管時幾乎沒有所要的黃酮成分可以洗脫下來。因此，大孔吸附樹脂的乙醇洗脫量為110 m L。

2.2 定性光譜分析

2.2.1 遼五味子黃酮的紫外—可見光譜分析遼五味 子 黃 酮 提 取 物 加 入 Na N02、Al（NO3）3和NaOH顯色處理后，經過紫外—可見分光光度計掃描得到圖譜6。由圖可知，紫外—可見光譜中有兩個主要的吸收峰組成，其中之一出現在430～450 nm（峰帶Ⅱ），另一個在490～500 nm（峰帶Ⅰ）。一般來說，峰帶Ⅱ是苯甲酰基引起的，而峰帶Ⅰ是由桂皮酰基系統引起。

圖6 紫外—可見光譜Fig.6 UV－visible spectrum

2.2.2 遼五味子黃酮的紅外分析取經過干燥的遼五味子黃酮樣品1 g，與100～200 mg經干燥的KBr粉末在紅外燈下，于瑪瑙研缽研磨均勻，壓成薄片，進行紅外光譜測定［11］，結果如圖6所示。由圖可見，波數3 415.76 cm－1為黃酮類化合物的羥基吸收峰；2 935.61 cm－1分子中飽和碳氫伸縮振動產生；波數1 735.17 cm－1的吸收峰是由C＝O引起。1 518.48 cm－1為芳環振動吸收引起；圖中1 074.21 cm－1為烷烴吸收峰；綜上所述，推測提取物為多羥基黃酮類物質。

圖7 黃酮的紅外光譜圖Fig.7 IR－spectrum of Ampelopsis gross edentate flavones

3 結語

通過對所選4種樹脂遼五味子黃酮的吸附與解吸性能的研究，篩選出HZ－818樹脂為理想的分離純化的樹脂，其吸附率為76.24%，解吸率為67.30%。

HZ－818樹脂對遼五味子黃酮吸附分離的最佳工藝參數為：上柱量為65 m L，上柱流量1 m L／min，以體積分數70%乙醇為洗脫液控制洗脫液流量1.5 m L／min，洗脫液用量為110 m L。純化物經光譜分析表明是多羥基黃酮類化合物。

（References）：

［1］王森，張建國.五味子的研究概況及期開發前景［J］.經濟林研究，2003，21（4）：126－127.

WANG shen，ZHANG jian－guo.General situation and developmental prospect onSchisandrachinensis（Turcz.）Baill［J］.Current Researching Situation on Forest area，2003，21（4）：126－127.（in Chinese）

［2］唐德才.中藥現代研究與臨床應用（第一卷）［M］.上海：上海科學技術出版社，1997.

［3］戴好富，周俊，彭再剛，等.北五味子的水溶性化學成分［J］.天然產物研究與開發，2000，13（1）：24－26.

DAI haofu，ZHOU jun，PENG Zai－gang，et al.Water －soluble chemical composition of fructus schisandrae［J］.Nature Product Research and Development，2000，13（1）：24－26.（in Chinese）

［4］李恒.北五味子的現代研究［J］.中國林副特產，2008，96（5）：97－99.

LI Heng.Current study of northeast schisandra chinensis（Turcz.）Baill［J］.Forest By－Product and Speciality in China，2008，96（5）：97－99.（in Chinese）

［5］曹群華，瞿偉菁，李家貴，等.大孔樹脂吸附純化沙棘籽渣總黃酮的研究［J］.中國中藥雜志，2004，29（3）：225－228.

CAO Qun－hua，ZHAI Wei－jing，LI Jia－gui，et al.Study on the purification capability of macroreticular resin flavonoids from seed residues of Hippophae rhamnoides（FH）［J］.Magazine on Medicine of Chinese，2004，29 （3）：225－228.（in Chinese）

［6］麻秀萍，蔣朝暉，楊玉琴，等.大孔吸附樹脂對銀杏葉黃酮的吸附研究［J］.中國中藥雜志，1997，22（9）：539－542.

MA Xui－ping，JIANG Cao－hui，YANG Yu－qin，et al.Study on the adsorption capability of macroreticular resin to flavonoids on the leaves of Ginkgo biloba［J］.Magazine on Medicine of Chinese，1997，22（9）：539－542.（in Chinese）

［7］榮紹豐，付艷麗，王濤，等.大孔吸附樹脂對發酵液中2－苯乙醇的吸附研究［J］.食品與生物技術學報，2010，29（5）：693－697.

RONG Shao－feng，FU Yan－li，WANG Tao，et al.Study on the adsorption capability of macroreticular resin to fermentation broth of 2－ phenyl ethanol adsorption［J］.Journal of Food Science and Biotechnology，2010，29（5）：693－697.（in Chinese）

［8］熊浩平.分光光度法測定顯齒蛇葡萄總黃酮含量［J］.食品科學，2004，25（2）：144－145.

XIONG Hao－ping.Determination the total flavonoids Ampelopsis content with spectrophotometry［J］.Food Science，2004，25（2）：144－145.（in Chinese）

［9］陳玉瓊，李安琪，孟燕.大孔樹脂純化藤茶黃酮及主要成分結構鑒定［J］.食品科學，2009，30（9）：51－55.

CHEN Yu－qiong，LI An－qi，MENG Yan.Purification flavonoids and major components identification on Ampelopsis［J］.Food Science，2009，30（9）：51－55.（in Chinese）

［10］楊紅.中藥化學實用技術［M］.北京：化學工業出版社，2004.

［11］沈秋仙.槲蕨根莖黃酮類物質提取條件的優化［J］.麗水學院學報，2005，27（5）：64－66.

SHEN quixian.Optimization of extracting condition of flavonoids from rhizoma of drynaria rhizoma drynariae［J］.Journal of Lishui University，2005，27（5）：64－66.（in Chinese）

Separation Purification and Spectrum of Flavonoids from LiaoSchisandrachinensis

MATao1，2，MAOHong－yan2，SHITai－yan1，ZHANGRui1

（1.Food Processing Institute，Liaoning Academy of Agricultural Sciences，Shenyang 110161，China 2.School of Food Science，Shenyang Agricultural University，Shenyang 110161，China）

This manuscript select four different macroporous resins that were used to static adsorption and desorption attached experiment for flavonoids of LiaoSchisandra chinensis（Turcz.）Baill.Among them，the highest adsorption capability of 76.24%and desorption rate of 67.30%were achieved at macroporous resin HZ－818 and was chosen.By using resin HZ－818，the optimum process conditions was determined and listed as follows：sample concentration 1.6 mg／m L，the sample size 65ml，and sample flow rate 1mg／min；70%ethanol as eluent at 1.5 m L／min，and eluent dosage for 110 m L.Under the optimum conditions，the elution ratio of flavones achieved at 79.57%.

LiaoSchisandrachinensis，favones，macroporous adsorption resin，spectral analysis

Q 657.32

A

1673－1689（2012）01－0101－05

2011－01－13

馬濤（1962－），男，新疆喀什人，理學博士，教授，博士研究生導師，主要從事糧油食品儲藏保鮮與深加工研究。Email：matao－09＠163.com