藥用真菌蟬擬青霉生物活性物質的研究進展

賀 亮， 馬素云， 程俊文， 李衛旗， 吳學謙

（1.浙江省林業科學研究院 浙江省森林資源生物與化學利用重點實驗室，浙江 杭州 310023；2.浙江大學 生命科學學院，浙江 杭州 310058）

藥用真菌蟬擬青霉生物活性物質的研究進展

賀 亮1， 馬素云2， 程俊文1， 李衛旗2， 吳學謙1

（1.浙江省林業科學研究院 浙江省森林資源生物與化學利用重點實驗室，浙江 杭州 310023；2.浙江大學 生命科學學院，浙江 杭州 310058）

蟬擬青霉為蟲草屬真菌，是中藥蟬花的無性型時期，具有較高的食用、營養和藥用價值，被認為是和冬蟲夏草相近的最具開發利用前景的珍貴菌類之一。作者在總結前人研究成果的基礎上，綜述了蟬擬青霉各種代謝產物、生物活性及發酵生產研究現狀，探討了在該研究領域存在的問題及今后的發展方向。

蟬擬青霉；活性物質；發酵培養

蟬擬青霉（Paecilomycescicadae）為麥角菌科（Clavicepitaceae）蟲草屬（Cordyceps）真菌，又名雌蟬花，屬半知菌類，為大蟬草（CordycepscicadaeS－hing）的分生孢子階段即無性型時期，是形成蟲草蟬花的真菌，我國把藥用菌作為藥材使用的歷史已很久遠，而蟬擬青霉則被視為“中藥八珍”之一，早在南北朝雷校《雷公炮炙論》就有加工記載［1］。蟬擬青霉中因含有核苷類物質、多球殼菌素、麥角固醇、蟲草酸、多糖、透明質酸及酶等次生代謝產物，具有許多生物活性功能如免疫調節、抗腫瘤、調節神經系統、改善腎功能、抗菌、抗病毒等。

蟬擬青霉與其寄生的蟲體復合體為蟬花，由于蟬花生長需要特定的生態環境和寄主昆蟲，再加上長期采挖，資源日趨枯竭，遠遠達不到市場需求。為了對極其有限的野生蟬花資源進行可持續的永久利用，可利用生物發酵技術來獲得高含量的蟬擬青霉有效成分。近些年來，蟲草類真菌的生產都可通過固體或液體培養獲得，某些活性成分甚至超過了原有天然菌類，此法不僅可以克服化學合成中可能存在的高成本及對環境污染問題，也可以避免人工栽培過程周期長、易受氣候、土壤和病蟲害等的影響。作者對蟬擬青霉中的活性成分、生物活性及人工培養現狀進行了綜述，為進一步高效利用該藥用真菌提供一定的理論基礎。

1 蟬擬青霉代謝活性物質

蟬花的無性型蟬擬青霉含有多種與其相同的有效成分，如核苷類物質、多球殼菌素、麥角固醇及其過氧化物、蟲草酸、透明質酸及大分子多糖和多種必需氨基酸、微量元素等。

1.1 核苷類物質

該類物質包含蟲草素、腺苷、鳥苷、尿苷、肌苷及胸苷等。蟲草素是一類核苷類抗生素，具有抗菌、抗病毒、干擾RNA及DNA合成，顯著抑制多種腫瘤生長的作用［2］。用反相高效液相色譜法對蟬擬青霉RCEF1081菌絲體的核苷類物質進行檢測，發現蟬擬青霉的蟲草素和鳥苷含量高于冬蟲夏草，分別是冬蟲夏草的18.5倍、2.8倍［3］。腺苷涉及到中樞神經系統中不同生理過程的調節、抑制中樞神經元的興奮性，可擴張冠狀血管及周圍血管、增加冠狀動脈血流量、降低血壓、減慢心率，以及抗腫瘤等作用［4－6］。蟬擬青霉RCEF0943菌株發酵菌絲體腺苷含量為1.062 mg／g，明顯高于天然的蟬花含量［7］。另外，可以用RT－HPLC法快速高效的檢測蟬擬青霉中腺苷的含量［8］。

1.2 多球殼菌素

多球殼菌素為長脂鏈α－氨基酸，具有抗菌活性和免疫抑制作用，由于它是鞘脂類生物合成的關鍵催化酶絲氨酸棕櫚酰轉移酶的抑制劑，還被開發成抗動脈粥樣硬化藥［9］。1989年藤多哲朗從蟬花培養濾液中提取分離到抗生素成分多球殼菌素，相對分子質量為401，分子內有α－氨基酸部分和不飽和脂肪鏈部分。從蟬擬青霉發酵液中提取的多球殼菌素可抑制小鼠淋巴細胞的增殖，小鼠注射或口服后多球殼菌素抑制羊紅血細胞引起的血小板形成及細胞毒T淋巴細胞異體反應。在人器官移植時環孢菌素A（Cs A）常作為免疫抑制劑，在體內和體外實驗表明其是Cs A的10到100倍，是潛在的臨床上有效免疫抑制物質［10］。楊明靜［11］發現葡萄糖和水解乳蛋白最有利于蟬花細胞生長，但是蔗糖和酵母粉最有利于次生代謝產物多球殼菌素的合成，所以可以通過發酵培養獲得多球殼菌素。利用多球殼菌素與茚三酮共熱時生成藍紫色酮茚胺，在一定范圍內吸光度和氨基酸含量成正比，建立了快速、高效茚三酮比色法測定蟬花ISP類免疫活性組分含量的方法［12］。

1.3 麥角固醇及其過氧化物

用甲醇可提取到蟬花麥角固醇及麥角固醇過氧化物，麥角固醇過氧化物可抑制植物凝集素（PHA）激活的T細胞增殖，是通過阻止細胞周期蛋白E，IFN－γ，IL－2，和IL－4的轉錄從而遏制 T 細胞從G1期進入 M期實現的［13－14］。蟬擬青霉菌絲中麥角固醇的質量分數為（0.625 6±0.030 9）mg／g，比天然蟬花的（0.574 3±0.018）mg／g要高［7］。

1.4 蟲草酸

蟲草酸即D－甘露醇，是蟲草類真菌中的重要有效成分之一，具有清除自由基、利尿、提高血漿滲透壓、降低顱內壓和眼內壓、治療腦水腫與青光眼及燒傷休克等并發的急性腎功能不全等作用，還可作為食品添加劑或經化學修飾后開發成新藥［15］。蟬擬青霉菌絲體中甘露醇檢測含量為（78.9±1.23）mg／g，而天然蟬花中只有（53.6±1.16）mg／g［7］。

1.5 多糖

研究表明：藥用真菌多糖具有免疫調節、抗腫瘤等活性［16］，已有研究證明蟬擬青霉多糖具有抗氧化、增強免疫功能、抗腫瘤、抗病毒的作用。

通過比較蟬擬青霉與其他幾種蟲草無性型及其相關真菌中SOD酶含量和酶活力，發現蟬擬青霉PC－1干重的SOD酶比活力最高且達874.3 U／g，所以蟬擬青霉在抗氧化方面具有良好開發前景［17］。蟬花菌絲體發酵胞外多糖也有一定清除有機自由基能力，不同培養基發酵培養的經不同乙醇量沉淀提取的總糖含量不同，其相應清除DPPH有機自由基和羥自由基的能力也有較為明顯的不同［18］。

蟬擬青霉多糖使大鼠肺泡巨噬細胞、腹腔巨噬細胞內酸性磷酸酶、乳酸脫氫酶等活力顯著升高，增強巨噬細胞的吞噬功能；使免疫器官（脾臟、胸腺等）的濕重、免疫細胞分泌細胞因子的能力、外周血白細胞數、血紅蛋白含量、血清總蛋白含量、球蛋白含量顯著增加；并能拮抗由于使用環磷酰胺所致的多種參數降低的作用；降低血液中膽固醇、甘油三酯水平，減少脂質過氧化物的生成，維持還原型谷胱甘肽的含量，具有增強清除自由基的能力。總之，蟬擬青霉具有增強免疫功能、改善營養狀況、改善脂類物質代謝、抗腫瘤作用［19－30］。蟬擬青霉對人癌細胞的作用也有研究，一定濃度的蟬擬青霉多糖能使外周血單個核細胞的增殖率升高，較高濃度多糖能抑制白血病細胞株U937、K562的增殖，同時能提高外周血單個核細胞表達h TNF－α、hIFN－γ。蟬擬青霉多糖可能具有直接抑制U937、K562的增殖作用，能提高外周血單個核細胞的增殖能力，使其分泌h TNF－α、hIFN－γ升高，從而可能促進外周血單個核細胞的殺腫瘤活性［31］。

蟬擬青霉多糖在體外能有效抑制乙型肝炎病毒 Hep G2.2.15細胞分泌 HBs Ag、HBe Ag，最大抑制率分別為44.8%、31.0%，對細胞內 HBV－DNA復制和TLR4 m RNA表達均有一定抑制作用［32］。

1.6 透明質酸

透明質酸是以乙酰氨基葡萄糖和葡萄糖醛酸為結構單元的高分子非蛋白酸性粘多糖，但和大多數多糖相比又有許多優勢，由于其高保濕、高彈性、高粘度、生物相容性好被廣泛應用與化妝品、藥品和醫學外科手術上［33－34］。通過發酵法獲得透明質酸是經濟、方便、快捷的途徑，而蟬擬青霉發酵液中含透明質酸量較高，可達11.353 mg／m L。用硅藻土過濾方法從蟬擬青霉發酵液中提取透明質酸，最佳條件為真空度0.07 MPa、硅藻土濾餅厚度0.9 cm、稀釋倍數為1倍、溫度為20℃，其平均透明質酸收率為83%［35］。

1.7 酶類

蟲草類真菌在入侵昆蟲體內的過程中，為使昆蟲表皮降解達到侵染目的，會分泌幾丁質酶、蛋白酶、酯酶、淀粉酶等降解酶。有研究表明蟬擬青霉孢子粉或懸浮液可以在小菜蛾幼蟲和蛹上寄生并導致小菜蛾死亡，室內和田間實驗均表明蟬擬青霉具有被開發成新型真菌殺蟲劑的潛力［36－37］。8株蟬擬青霉分生孢子懸液、菌絲懸液對蠶豆蚜蟲的致病性有一定差異，孢子懸液的致病性強于菌絲懸液，其中GZDXIFR4611菌的感染致死效果最好，其孢子懸液致死率可達到86.7%，菌絲懸液的致死率可達到66.7%［38］。所以蟬擬青霉對這些有害昆蟲致死的作用與其分泌的降解酶可能有關。歐翔等［39］從8株蟬擬青霉菌中篩選出酶活力最高菌株GZDXIFR3716，其胞內幾丁質酶、蛋白酶、溶菌酶最佳發酵培養基組成為葡萄糖20 g／L、酵母膏5 g／L、K2HPO41 g／L，酶含量最高的發酵時間分別為48、60、84 h，最適反應溫度為50、40、40℃，最適p H 值分別為6.0、7.0、5.0。對蟬擬青霉中的幾丁質酶基因進行初步研究，也為研究蟬擬青霉對昆蟲的毒力與幾丁質酶的關系奠定基礎，獲得該菌的幾丁質酶基因后若能將其轉入植物，還可以用來防止植物真菌性病蟲害［40］。

1.8 其他

蟬擬青霉P3菌株菌絲體和發酵液甲醇提取物具有較強的清除自由基活性，兩者也具有抗真菌活性，其中發酵液提取物的活性較強［41］。蟬擬青霉RCEF0947菌株發酵液和菌絲體甲醇、乙酸乙酯提取物均具有一定的體外抑制單胺氧化酶活性，對中國倉鼠卵巢細胞株的IC50分別為122.35μg／m L和171.93μg／m L［42］。用體積分數40%乙醇、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇、大孔吸附樹脂柱、HPLC、Sephadex A－20從蟬擬青霉子實體中提取殺蟲物質可有效殺滅小菜蛾，質量濃度在10.0 mg／m L分別在24，48和72 h死亡率為（95.1±1.8）%，（97.7±1.6）%，（99.1±1.7）%［43］。

人工培養蟬花菌絲可減輕腎小球的損害，改善動物的腎功能和腎衰竭并發癥，延緩腎小球硬化的進程［44－46］，其機制可能具有下調 PAI－1的表達，使腎小球毛細血管襻上u－PA的表達相應增高，使腎小球內 Col－Ⅳ的表達量減少［47］。

2 蟬擬青霉培養

由于資源的限制天然蟬花的產量遠遠達不到人們的需求，而用人工培養方法可以快速高效的解決這個問題。常用的人工培養方法包括固體培養和液體深層發酵，人工培養是為了供給微生物合成體細胞及其代謝產物所需的氮源和碳源，供合成反應及生命活動所需的能量，調節新陳代謝作用以及提供最佳的非營養因素。

2.1 固體培養

固體培養由于接近其天然生長環境，可以觀察其生長特性并且有可能其活性物質與天然蟬花更接近，目前已有工廠化模擬生產應用。早期的對蟬花菌種進行固體培養，發現接種10 d后開始產生孢梗束，初期孢梗束乳黃或淺黃色、多頭、成塊狀或珊瑚狀，逐漸伸長成柱狀、掌狀，近頂端多次分枝；孢梗束成叢或單生、有明顯趨光現象，通常采收期為40 d；老培養物孢梗束倒伏、產生大量成堆的分生孢子，在固體培養基上生出類似寄主體上的孢梗束［48］。用9種碳源、9中氮源和10種不同碳氮比對蟬擬青霉菌絲進行固體培養，發現其生長最適碳源、氮源、碳氮比分別為可溶性淀粉、蛋白胨、40∶1［49］。20株蟬擬青霉對家蠶幼蟲和蠶蛹都有不同程度的感染，感染后期部分菌株能產生孢梗束，但從感染率和產生孢梗束情況看，蠶蛹效果比幼蟲好，可能是幼蟲和蠶蛹體內營養成分的差異引起［50］。

2.2 液體培養

隨著蟬擬青霉研究的深入和發酵產業的成熟，蟲草屬真菌可通過深層液體發酵而獲得，利用液體發酵時間短、生長條件易于控制的優點可以滿足不同發育時期對營養的特殊要求和以及不同目的產物的生產需求。

培養基中碳氮源種類、含量及質量比不同均會影響菌絲、孢子的生長。蟬擬青霉用葡萄糖作碳源孢子產量高，用果糖菌絲體產量高，但不利用菊糖、L－山梨糖、L－鼠李糖［51］。陳祝安等發現馬鈴薯－蔗糖、Richard、Czapek較適合蟬擬青霉的發酵培養初期，其中Richard基在液面形成孢梗束多而生長好，若以分生孢子為利用目的Richard基則是的十分合適的培養基［48］，可能是因為孢子和菌絲體生長利用碳源的傾向性不同。通過正交實驗確定蟬擬青霉的最佳培養條件為葡萄糖20 g／L、酵母提取物5 g／L、K2HPO41 g／L，其中碳源是促進菌絲生長的最重要因素［52］。對蟬擬青霉液體培養基進行篩選發現培養基中含有蠶蛹粉、雞蛋等動物源成分效果較好，該培養基下培養4 d，菌絲收率135 g／L，可能提供了類似真菌寄主體內激素等促進因子［53］。所以，不管是對孢子還是菌絲體生長碳源都是影響蟬擬青霉最主要的因素，而天然的有機氮源含一些生物體所需的微量成分也能促進生長。

不同目的產物所需的生產條件不同。蟬擬青霉產透明質酸的最佳培養基配方為質量分數6%的乳糖、質量分數0.5%的牛肉膏與酵母膏的混合物（1∶1）以及質量分數0.1%的 MgSO4·7 H2O，而且液體發酵產生的透明質酸游離在發酵液中利于分離提取［54］。除了碳氮源等營養物質的影響，接種量、p H、溫度等也會在一定程度上影響活性成分的產生，蟬擬青霉多糖產量的最佳液體發酵條件為以7%的接種量將濃度為107個／m L的孢子懸液接入裝液量為20%的液體培養基中，于p H 7、27℃、150 r／min的轉速下發酵7 d，0305－3菌株的多糖產量可達3.24 g／L［55］。但高濃度營養物質反而對生物量和多糖的產量有負作用。在培養144 h后，生物量達到最大值31.07 g／L；培養168 h后，蟬擬青霉多糖達到最高質量濃度3.24品種效益年g／L，大致與生物量變化的趨勢呈正相關；但是當培養基中添加的同源多糖質量濃度大于0.6 g／L時，蟬擬青霉菌絲體及多糖的產生明顯受到抑制，隨著培養液中同源多糖濃度的增加，反饋抑制作用逐漸增強，當質量濃度達到2.2 g／L時，蟬擬青霉菌絲體的生長和多糖的產生完全被抑制。可能是蟬擬青霉多糖的合成途徑不止一條，有多種合成酶受代謝終產物蟬擬青霉多糖的調節作用，只有當蟬擬青霉多糖濃度足以使所有合成途徑的關鍵酶的活性受到抑制時，多糖無法合成、菌絲無法生長；也可能與細胞壁的通透性對同源多糖的耐受量有關［56］。蟬擬青霉的次生代謝產物蟲草素也可以通過液體發酵提高產量，有人確立了高產蟲草素的液體培養工藝，按質量分數分別為麩皮3%，酵母粉4%，絲氨酸0.15%，KH2PO40.05%，MgSO4·7 H2O 0.01%，CaCl20.02%；最佳培養條件為：起始p H 6.0，裝液量80 m L／250 m L，接種量體積分數5%、25℃、130 r／min培養4 d，在此條件下培養其蟲草素含量最高［57］。

3 展望

天然蟬擬青霉與冬蟲夏草同屬且具有毒性小、易培養的優點，有希望作為蟲草的替代品。目前蟬擬青霉的生長需要特定的生態環境和寄主昆蟲，故資源稀少，再加上長期采挖，資源日趨枯竭，已不能滿足臨床需求。鑒于蟬擬青霉自然資源十分有限、人工種植又相當困難的嚴峻現狀，采用現代生物發酵技術來培養人工蟬擬青霉菌絲體原料及提高其次生代謝產物含量幾乎成了解決問題的唯一而根本的的出路。

進一步提高蟬擬青霉發酵生產核苷類、多球殼菌素、多糖等活性物質的產量并開發蟬擬青霉中新的次生代謝物質是亟待解決的問題，現有的固體發酵或液體發酵技術各具有優缺點［58］，若能采用固液混合發酵技術，既可以培養新的次生代謝活性物質又可以快速提高含量，同時結合一些數學模型如響應面法［59］、人工神經網絡法［60］等，可以大大提高藥用真菌蟬擬青霉的產量，為后續建立有效的分離純化工藝和選擇快捷有效的定量測定方法提供基礎。

目前很多研究停留在以原藥為試驗材料的水平上，相應的功能組份尚未明確，蟬擬青霉中有多種與天然蟬花相同的活性成分，而對其提取分析的研究較少。因此，開發高效快速提取檢測活性物質方法，對解決當前資源短缺的現狀有重要作用。

隨著現代分子生物學的發展，在基因和蛋白質水平對生物進行研究逐漸成為熱點，應用分子生物學從生理生化、營養代謝等方向提高蟬擬青霉的藥用和食用價值有可能成為新的發展方向。

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Review on Bioactive Components from Medicinal Fungus ofPaecilomycescicadae

HELiang1，MASu－yun2，CHENGJun－wen1，LIWei－qi2，WUXue－qian1
（1.Zhejiang Forestry Academy，The Key Laboratory of Biochemical Utilization of Zhejiang Province，Hangzhou 310023，China；2.College of Life Sciences，Zhejiang University，Hangzhou 310058，China）

Paecilomycescicadae（Ascomycetes），a major parasitic fungus，not only has extremely high edible and nutritional values，but also contained some medicinal components.It is well known as one of the precious edible fungus likeCordycepssinensisand is especially worthy of exploitation and utilization.Based on the related reports onPaecilomycescicadaein recent years，this review summarized the metabolites from thePaecilomycescicadaecultured cellspharmacological effect and fermentation culture ofPaecilomycescicadae.Finally the existing problems and the perspective were deeply discussed.

Paecilomycescicadae，bioactive components，fermentation culture

Q 939.5

A

1673－1689（2012）01－008－09

2010－12－27

國家自然科學基金青年科學基金項目（31000281）；浙江省自然科學基金項目（Y2091038）。

賀亮（1979－），男，陜西大荔人，工學博士，副研究員，主要從事食藥用菌發酵及次生代謝產物研究。Email：kite006＠163.com