幾種酚酸對木聚糖酶活力的影響

田 野， 歐仕益

（暨南大學(xué) 食品科學(xué)與工程系，廣東 廣州 510632）

幾種酚酸對木聚糖酶活力的影響

田 野， 歐仕益＊

（暨南大學(xué) 食品科學(xué)與工程系，廣東 廣州 510632）

采用3，5－二硝基水楊酸法（DNS法）測定酶解后還原糖釋放量，研究4種不同酚酸（阿魏酸、對－香豆酸、水楊酸、單寧酸）對木聚糖酶活力的影響。結(jié)果表明：阿魏酸、對－香豆酸、水楊酸能提高木聚糖酶活力，當這3種酚酸質(zhì)量濃度為0.75 mg／m L時，酶活力分別提高65.59%、46.21%和12.83%。單寧酸抑制木聚糖酶活性，添加量為0.50 mg／m L時，抑制率達37.18%。動力學(xué)研究表明：上述4種酚酸均能提高酶與底物的親和力，對－香豆酸能提高酶反應(yīng)速度，但單寧酸會使反應(yīng)速度顯著降低。

酚酸；木聚糖酶；酶活力

纖維質(zhì)主要由纖維素、半纖維素和木質(zhì)素組成，它是地球上最大的可再生資源［1］。利用纖維質(zhì)降解發(fā)酵生產(chǎn)燃料乙醇是目前的熱門課題［2，3］。目前制約纖維質(zhì)生物酒精生產(chǎn)的主要障礙是酶解成本過高，約占總生產(chǎn)成本的40%～55%［4－6］。因此，提高酶解效率對于解決生物能源問題具有重要意義。

植物秸稈中含有質(zhì)量分數(shù)0.4%～3.6%的酚酸，主要是阿魏酸和對－香豆酸，它們通常是通過酯鍵與低聚糖側(cè)鏈上的糖殘基相連［7－11］。Anderson和Akin研究發(fā)現(xiàn)：一些富含酯化阿魏酸、香豆酸但不含木質(zhì)素的細胞很難酶解，如C4植物維管束鞘薄壁細胞［12］；而 Mussatto等人先用堿預(yù)處理啤酒大麥渣再用纖維素酶降解，發(fā)現(xiàn)葡萄糖和纖維二糖釋放率增加4倍［13］。

這些研究表明，酚酸對纖維質(zhì)降解的兩種主要酶纖維素酶和木聚糖酶似乎影響較大，但直接研究酚酸對這兩種酶的影響國內(nèi)外尚未見報到。作者將4種不同質(zhì)量分數(shù)的酚酸添加到木聚糖酶反應(yīng)體系中，研究酚酸對木聚糖酶的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

木聚糖：廣州市齊云生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；木聚糖酶（2500FXU）：諾維信（中國）生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；阿魏酸（純度：98%）：上海試劑一廠產(chǎn)品；對－香豆酸（SIGMA）：廣州市齊云生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；單寧酸：天津市福晨化學(xué)試劑廠產(chǎn)品；水楊酸：天津市大茂化學(xué)試劑廠產(chǎn)品；其它所用試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

SHA－B水浴恒溫振蕩器，江蘇金壇市醫(yī)療儀器廠產(chǎn)品；HH－4恒溫水浴鍋，江蘇金壇市宏華儀器廠產(chǎn)品；KDC－1044低速離心機，科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司產(chǎn)品；UV－9600紫外可見分光光度計，北京瑞利分析儀器公司產(chǎn)品。

1.3 酚酸對酶活力的影響

1.3.1 酚酸對木聚糖酶活力的影響用0.1 mol／L醋酸－醋酸鈉緩沖液（p H＝5.5）配制質(zhì)量分數(shù)分別為0.50%的木聚糖液和0.20%的木聚糖酶液，分別配 制 0.05%、0.10%、0.15%、0.20%、0.25%、0.30%的下列酚酸溶液：阿魏酸、對－香豆酸、水楊酸、單寧酸。取100 m L三角瓶，各加入20 m L木聚糖液、10 m L木聚糖酶液和10 m L酚酸溶液，在55℃、轉(zhuǎn)速100 r／min下，振蕩培養(yǎng)3h后，放入沸水浴中滅活15 min終止反應(yīng)。離心，取1 m L上清液用3，5－二硝基水楊酸法（DNS法）測定還原糖，各處理重復(fù)3次。

1.3.2 酚酸影響木聚糖酶活性的動力學(xué)研究

1）阿魏酸、對－香豆酸、水楊酸影響木聚糖酶活性的動力學(xué)研究 用0.1 mol／L醋酸－醋酸鈉緩沖液（p H＝5.5）配制質(zhì)量分數(shù)為 0.20%、0.40%、0.60%、0.80%和1.00%的木聚糖溶液及0.004%的木聚糖酶液。分別配制0.25%的下列酚酸溶液：阿魏酸、對－香豆酸、水楊酸。取5支10 m L試管分別加入2 m L木聚糖酶液，在55℃水浴中孵育10 min后，再分別加入4 m L不同濃度的木聚糖液和2m L酚酸溶液，繼續(xù)孵育5 min。立即置于沸水浴中滅活。離心，取2 m L上清液用3，5－二硝基水楊酸法（DNS法）測定還原糖，各處理重復(fù)3次。采用Lineweaver－Burk雙倒數(shù)法制得酶動力學(xué)曲線并計算Km和Vmax值。

2）單寧酸影響木聚糖酶活性的動力學(xué)研究分別配制質(zhì)量分數(shù)為0.25%的單寧酸和0.4%的木聚糖酶液（0.1 mol／L、p H＝5.5醋酸－醋酸鈉緩沖液配制），按上述方法進行試驗。采用Lineweaver－Burk雙倒數(shù)法制得酶動力學(xué)曲線并計算Km和Vmax值。

1.4 統(tǒng)計分析

各組還原糖含量數(shù)據(jù)為3次平行測定值（平均值±標準誤差）。用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件，單因素方差分析（ANOVA）中采用Duncan檢驗，P≤0.05時為顯著差異。

2 結(jié)果與分析

由表1可知，阿魏酸、對－香豆酸、水楊酸均能提高木聚糖酶的活力。隨著酚酸質(zhì)量分數(shù)的增加，催化體系中的還原糖質(zhì)量濃度也隨之升高。當阿魏酸、對－香豆酸、水楊酸的質(zhì)量濃度達到0.75 mg／m L 時，促 進 率 分 別 為 65.59%、46.21% 和12.83%。

單寧酸會抑制木聚糖酶的活性，這種抑制作用在單寧酸質(zhì)量濃度為0.50 mg／mL時達到最大，此時的抑制率為37.18%。當體系中單寧酸質(zhì)量濃度超過0.50 mg／mL時，還原糖質(zhì)量濃度會有所回升。

由表2和表3所示，與未加酚酸樣相比，阿魏酸和水楊酸均表現(xiàn)為最大反應(yīng)速度基本不變，而Km值明顯減小；這表明阿魏酸和水楊酸能夠增加木聚糖酶對底物的親和力。而對－香豆酸的動力學(xué)結(jié)果表現(xiàn)為最大反應(yīng)速度增大，Km值減小，其變化較小，表明對－香豆酸不僅能提高酶與底物的親和力，還能作用于酶－底物復(fù)合物，使其分解速度增加并促進木糖的生成從而提高木聚糖酶活力。與上述3種酚酸相反，單寧酸對木聚糖酶的抑制作用，表現(xiàn)為最大反應(yīng)速度和Km值均顯著減小，這說明單寧酸既能作用于游離的木聚糖酶，提高其親和力，又能與酶－底物復(fù)合物結(jié)合，降低酶反應(yīng)速度，從而表現(xiàn)對木聚糖酶的抑制作用。

表1 不同酚酸對木聚糖酶釋放還原糖的影響（n＝3）Tab.1 Effect of phenolic acids concentrations on the released o reduce sugars from xylanase（n＝3）

表2 阿魏酸、對香豆酸和水楊酸對木聚糖酶（10μg／mL）活性影響的動力學(xué)測定結(jié)果（n＝3）Tab.2 Effect of ferulic，coumaric and salicylic acid concentration on the kinetics activity of xylanase（n＝3）

表3 單寧酸對木聚糖酶（1 mg／m L）活性影響的動力學(xué)測定結(jié)果（n＝3）Tab.3 Effect of tannic acid on the kinetic activity of xylanase（n＝3）

目前，酚酸對木聚糖酶的影響國內(nèi)外還未見報到。研究結(jié)果表明：添加阿魏酸、對－香豆酸、水楊酸能提高木聚糖酶活性，說明堿預(yù)處理提高解纖維質(zhì)的降解率主要是打斷酚酸對纖維質(zhì)的交聯(lián)，但同時也可能因為釋放出阿魏酸等酚酸而增加酶解效率，但3種酚酸影響木聚糖酶的作用機理還有待進一步研究。

單寧酸對酶促反應(yīng)的抑制作用可能是多方面因素共同作用的結(jié)果：1）酶的化學(xué)本質(zhì)是蛋白質(zhì)，與一般的蛋白質(zhì)一樣，酶與單寧結(jié)合生成不溶性的結(jié)合物，該結(jié)合物較酶的構(gòu)型有所改變，從而造成酶活力的降低或喪失；2）對于以生物大分子為底物的酶促反應(yīng)，單寧酸也可同底物結(jié)合，剝奪酶的催化底物或生成能降低酶活性的化合物；3）金屬離子，例如 Mg2＋、Zn2＋、Mn2＋對某些酶起到了激活作用，有的還可作為酶的輔基，而單寧對金屬離子具有絡(luò)合作用，進而抑制酶活力［14］。

3 結(jié)語

阿魏酸、對－香豆酸、水楊酸能提高木聚糖酶的活力。這3種酚酸對木聚糖酶促進效果最大時的質(zhì)量濃度均為0.75 mg／m L，此時的促進率分別為65.59%、46.21%和12.83%；其動力學(xué)研究表明：添加上述酚酸均可以提高酶與底物的親和力，而且對－香豆酸還會增大酶反應(yīng)速度。

單寧酸對木聚糖酶具有抑制作用，表現(xiàn)為既提高酶與底物的親和力且顯著降低酶反應(yīng)速度。單寧酸對木聚糖酶的最大抑制質(zhì)量濃度為0.50 mg／m L，最大抑制率為37.18%，超過最大抑制質(zhì)量濃度，其抑制效果會有所降低。

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Influence of Phenolic Acids on Activity of Xylanase

TIANYe，OUShi－yi＊
（Department of Food Science and Engineering，Jinan University，Guangzhou 510632，China）

In this manuscript，effect of four phenolic acids，including ferulic，coumaric，salicylic and tannic acid，on the activity of xylanase was investigated through determination of reducing sugars releasing from xylans.The results showed that 0.75 mg／m L ferulic，coumaric and salicylic acid could increased the activity of xylanase by 65.59%，46.21%and 12.83%，respectively.However，tannic acid was found as inhibitor of xylanase，and the activity decreased 37.18%when 0.50 mg／m L was presented.The results of enzyme kinetics showed that these phenolic acids increased the affinity of xylanase for the substrate.The reaction speed increased with coumaric acid added，and significantly reduced by tannic aci

phenolic acid，xylanase，activity

Q 946.5

A

1673－1689（2012）01－096－05

2011－02－25

廣東高校科技成果產(chǎn)業(yè)化重大項目（cgzhzd0709）。

＊

歐仕益（1963－），男，湖南長沙人，教授，主要從事食品化學(xué)及功能性食品研究。Email：tosy＠jnu.edu.cn