一種真菌漆酶的克隆與序列分析

馬文寅， 蔡宇杰＊， 廖祥儒， 胡 艷， 李枝玲， 張大兵

（1.江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫 214122；2.江蘇漢邦科技有限公司，江蘇 淮安 223001）

一種真菌漆酶的克隆與序列分析

馬文寅1， 蔡宇杰＊1， 廖祥儒1， 胡 艷1， 李枝玲2， 張大兵2

（1.江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫 214122；2.江蘇漢邦科技有限公司，江蘇 淮安 223001）

比較了幾種不同真菌DNA提取方法對(duì)血紅密孔菌基因組的提取的影響，根據(jù)GenBank中真菌漆酶氨基酸保守序列設(shè)計(jì)的簡并引物，以血紅密孔菌基因組總DNA為模板，擴(kuò)增到一條長度為1084 bp的DNA片段。通過BLAST比對(duì)，其基因序列與密孔菌屬同源性最高，為99%，氨基酸同源性為88%，說明擴(kuò)增的片段確為密孔菌漆酶基因。

漆酶；克隆；序列分析；血紅密孔菌

漆酶（Laccase，EC 1 1.0.3.2）是一種多酚氧化酶，最早是從漆樹中發(fā)現(xiàn)的［1］。漆酶廣泛存在于真菌以及植物中，某些昆蟲、細(xì)菌也能夠分泌漆酶［2］，主要包括漆樹漆酶（rhus lactase）和真菌漆酶（fungal lactase）兩大類。漆酶可以氧化降解多酚類化合物及其衍生物，具有氧化與木質(zhì)素有關(guān)的酚類和非酚類化合物以及高度難降解環(huán)境污染物的能力［3］，且作用范圍較廣。因此，它們?cè)谏镏茲{，生物漂白，芳香化合物脫毒，環(huán)境垃圾處理等［4］，以及生漆的干燥成膜和毛發(fā)染色、紙漿生產(chǎn)中木質(zhì)素的降解、生物傳感器、酶法免疫分析、有機(jī)合成、土壤修復(fù)等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景［5］。白腐菌是真菌中漆酶主要的生產(chǎn)者［6］，但培養(yǎng)的過程中周期較長，在培養(yǎng)過程中容易被污染，不利于工業(yè)化生產(chǎn)［7］。而且隨著環(huán)境越來越受到人們的重視，漆酶的研究也越來越受到人們的關(guān)注。目前國內(nèi)對(duì)漆酶分子水平的研究還處于初步階段，許多生理機(jī)制還不能夠從分子水平對(duì)其進(jìn)行合理的分析，因此，對(duì)漆酶在基因水平的研究也顯得越來越重要。作者采用基因擴(kuò)增的方法，從血紅密孔菌基因組中成功克隆出漆酶的基因片段，對(duì)其進(jìn)行了序列分析。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株血紅密孔菌，PycnoporussanguineusSYBC－L1，作者所在實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 試劑Biospin真菌基因組DNA提取試劑盒：購自南京博飛科技有限公司；Taq DNA聚合酶、d NTP Mixture、Buffer、marker、PCR 產(chǎn)物純化試劑盒：均購自寶生物（大連）有限公司；引物：南京金斯瑞生物有限公司合成；瓊脂糖：進(jìn)口分析純；其余試劑均為進(jìn)口或國產(chǎn)分析純。

1.1.3 儀器超凈工作臺(tái)（SW－CJ－1FD）：杭州齊威儀器有限公司產(chǎn)品；回轉(zhuǎn)式恒溫?fù)u床（HZC－250）：杰瑞爾電子有限公司產(chǎn)品；恒溫培養(yǎng)箱（LHS－250 HC）：江蘇州江東精密儀器有限公司產(chǎn)品，基因擴(kuò)增儀（TC－96／G／H（b）A）：杭州博日科技有限公司產(chǎn)品，電泳儀，凝膠成像系統(tǒng)。

1.2 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件

發(fā)酵培養(yǎng)基（g／L）：土豆200，葡萄糖20，愈創(chuàng)木酚1 m L。121℃滅菌，p H值自然。

菌絲收集：將菌種接種到250 m L搖瓶，裝液量50 m L，30℃培養(yǎng)48 h。用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.9%的生理鹽水洗滌數(shù)次，直至洗滌液呈無色，離心盡量除去上清液，收集菌體，－20℃保存。

1.3 基因組提取方法

分別采用CTAB法、植物提取方法、基因組試劑盒的方法提取基因組DNA。

1.3.1 CTAB法參照 Guo等［8］的方法。取0.2 g收集的菌體，加入液氮研磨至粉末，迅速轉(zhuǎn)入1.5 m L的離心管中，并加入裂解液（質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%CTAB），65 ℃水浴45 min，13 000 r／min離心10 min；取上清于一新的離心管中，加等體積的混合溶液V（氯仿）∶V（異戊醇）＝24∶1，12 000 r／min離心10 min；取上清，加2倍體積的無水乙醇和2 mol／L的NaCl溶液，－20℃沉淀30 min，12 000 r／min離心20 min；收集沉淀，體積分?jǐn)?shù)75%乙醇溶液沖洗，洗滌時(shí)注意切勿將沉淀倒出，在超凈工作臺(tái)中真空干燥；加入100μL TE緩沖液溶解DNA，－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 植物基因組提取方法質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%CTAB抽提緩沖液在65℃水浴中預(yù)熱；取少量菌體置于研缽中，液氮研磨至粉末轉(zhuǎn)移至離心管中；加入700μL的質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%CTAB抽提緩沖液，輕輕搖勻；置于65℃水浴鍋中保溫，每隔10 min輕輕搖動(dòng)幾下，使混合均勻，30 min后取出；冷卻2 min后加入等體積的V

（氯仿）∶V（異戊醇）＝24∶1，振蕩2～3 min，使兩者混合均勻；10 000 r／min離心10 min，與此同時(shí)，將600μL的異丙醇加入另一個(gè)新的離心管中；10 000 r／min離心1min后，將上清液轉(zhuǎn)入含有異丙醇的離心管中，上下?lián)u動(dòng)30 s，使之充分混合；10 000 r／min離心1min后，倒掉上清，注意勿將沉淀倒出；加入800μL體積分?jǐn)?shù)75%的乙醇溶液洗滌沉淀；加入50μL TE緩沖液，溶解DNA；置于－20℃保存?zhèn)溆茫?］。

1.3.3 試劑盒提取方法參照試劑盒說明書進(jìn)行操作。取不多于50 g懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞，離心去除上清，液氮研磨，放入1.5 m L的離心管中（注意：樣本的磨碎程度將影響裂解效果）；加400μL LE Buffer，并混合均勻，混合充分有助于裂解（可選：加入4 μL的100 mg／m L RNase A）；與65℃環(huán)境中溫浴15～30 min（溫浴過程中可間或振蕩離心管2－3次），然后移除（對(duì)于難裂解的樣本可適當(dāng)延長溫浴時(shí)間）；加入130μL DA Buffer，混合均勻后于冰浴中放置5 min；于14 000 r／min離心3 min；將上清液轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的1.5 m L離心管；加入750μL或?yàn)V液體積1.5倍的E Binding Buffer，并混合均勻；將混合液體轉(zhuǎn)移至Spin column；于6 000 r／min離心1 min，并棄去接液管中的液體；由于混合液體體積大于750μL，分兩次離心過柱；向Spin column中加入500μL的G Binding Buffer；于10 000 r／min離心30 s，棄去接液管中液體；Spin column中加入600μL的 Wash Buffer；于10 000 r／min離心30 s，并棄去接液管中液體；上一步驟重復(fù)一次；再次將Spin column于10 000 r／min離心1 min，并將Spin column轉(zhuǎn)移至一個(gè)新的1.5 m L離心管；向Spin column中加入100μL至200μL Elution Buffer，并于室溫溫浴1 min；于12 000 r／min離心1 min，并棄去Spin column；1.5 m L離心管液體含有DNA；于－20℃保存。

1.4 PCR擴(kuò)增

1.4.1 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)GenBank中漆酶的保守氨基酸序列，采用blastp比對(duì)其同源性，通過Primer Premier 5和Oligo 7.0軟件設(shè)計(jì)一對(duì)簡并引物，上游引物：ATGTCCAGATTCC AATCTCTCC；下游引物：GAGATCGCTGGGGTCCAAGTG。

1.4.2 PCR擴(kuò)增以血紅密孔菌基因組總DNA為模板，進(jìn)行PCR的擴(kuò)增。反應(yīng)體系20μL，包括：PCR Buffer 2μL；Mg2＋1.5μL；d NTPs 2.5μL；上下游引物各1μL；Taq DNA聚合酶0.2μL；DNA模板3μL；加入dd H2O至20μL。PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸2 min，34個(gè)循環(huán)之后72℃充分延伸10 min。擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，產(chǎn)物經(jīng)體積分?jǐn)?shù)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.4.3 進(jìn)化樹的構(gòu)建利 用 Clustalx2.0結(jié)合MEGA5.0，構(gòu)建PycnoporussanguineusSYBC－L1的系統(tǒng)發(fā)育樹。首先將擴(kuò)增得到的漆酶基因序列通 過 BLAST （http：／／www.ncbi.nlm.nih.gov／BLAST）尋找相似序列以進(jìn)行同源分析。采用Clustalx2.0對(duì)在NCBI查找的具有同源性的漆酶基因序列進(jìn)行多序列比對(duì)，用UltraEdit進(jìn)行序列調(diào)整，采用軟件 Mega5.0用鄰位相連法（neighborjoining，NJ）構(gòu)建（Kimura 2－parameter distance calculation）進(jìn)化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因組DNA提取結(jié)果

用3種方法進(jìn)行DNA的提取，每個(gè)樣品使用移液槍吸取2μL進(jìn)行凝膠電泳檢測(cè)（電壓80 V，時(shí)間40 min），配制體積分?jǐn)?shù)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其結(jié)果，結(jié)果如圖1所示。從圖中可以看出，幾種基因組提取的方法對(duì)DNA的提取效果并無明顯的區(qū)別，提取的DNA模板完全可以滿足基因擴(kuò)增的要求。采用試劑盒的方法提取，與其他方法相比，時(shí)間較短，能夠迅速地提取出DNA模板，進(jìn)入下一步實(shí)驗(yàn)；CTAB法是由于真菌細(xì)胞結(jié)構(gòu)與植物相似而借鑒的植物提取法，因此兩者提取方法大同小異。無論采用哪種方法，對(duì)于菌體的處理都是首要的，首先要研磨充分，且要在研磨充分時(shí)及時(shí)加入裂解液，使得釋放的DNA及時(shí)溶解在裂解液中，而不會(huì)遭到破壞［10］。

如果需要提取較高純度的模板，可以對(duì)以上幾種方法再進(jìn)行改良加工，加入RNase A，可以較好地除去RNA雜質(zhì)。在提取或者純化的過程中，如在液氮研磨時(shí)，若操作較劇烈，易導(dǎo)致DNA的斷裂，因此要注意操作的溫和性。

2.2 基因片段的擴(kuò)增

采用簡并引物擴(kuò)增的基因片段，用體積分?jǐn)?shù)1%的凝膠電泳檢測(cè)得到兩條片段，利用凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果，如圖2。將條帶進(jìn)行切膠回收，經(jīng)測(cè)序，得到長度為1 084 bp的基因序列。將測(cè)序所得到的基因序列在NCBI上利用blastn進(jìn)行基因序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)該基因序列與密孔菌屬的Pycnoporuscoccineus和Pycnoporussanguineus均有較高的同源性，相似度最大達(dá)到99%，說明擴(kuò)增得到的基因片段為密孔菌漆酶的基因序。

圖1 基因組DNAFig.1 Genomic DNA

圖2 簡并引物擴(kuò)增基因片段Fig.2 Laccase gene fragment amplified

2.3 基因序列分析

經(jīng)DNAMAN軟件分析，擴(kuò)增的基因片段含有1 084個(gè)堿基，編碼360個(gè)氨基酸。利用NCBI上的blastx比對(duì)分析，擴(kuò)增出的基因片段編碼的氨基酸序列與Pycnoporuscoccineus相似，同源性達(dá)到88%，與堿基序列比對(duì)結(jié)果一致。

表1 擴(kuò)增漆酶基因片段與其他真菌漆酶基因同源性比較Tab.1 Homology alignment of the amplified fragment and other fungi laccase genes

表2 擴(kuò)增漆酶基因片段與其他真菌漆酶氨基酸序列同源性比較Tab.2 Homology alignment of the amplified fragment and the amino acid sequences of other fungi laccase genes

圖3 14種不同來源漆酶氨基酸序列比對(duì)Fig.3 Homology alignment of the fourteen amino acid sequences

圖4 來源于Pycnoxcporus sanguineus漆酶的氨基酸序列比對(duì)Fig.4 Alignment of amino acid sequence of laccase from Pycnoporus sanguineus

圖5 來源于Pycnoporus coccineus漆酶的氨基酸序列比對(duì)Fig.5 Alignment of amino acid sequence of laccase from Pycnoporus coccineus

圖6 來源于Pycnoporus cinnabarinus漆酶的氨基酸序列比對(duì)Fig.6 Alignment of amino acid sequence of laccases from Pycnoporus cinnabarinus

漆酶一般含有4個(gè)銅離子，分別結(jié)合在3個(gè)高度保守的結(jié)合區(qū)域。根據(jù)光譜學(xué)特性，漆酶所包含的4個(gè)銅離子可以分為3類：Ⅰ類和Ⅱ類銅離子各一個(gè)，Ⅲ類銅離子兩個(gè)。漆酶的來源不同，蛋白質(zhì)也有很大差異，甚至來源相同的漆酶相對(duì)分子質(zhì)量也會(huì)不同，但是結(jié)合銅離子的區(qū)域的同源性卻很高，即銅原子連接的1個(gè)Cys和10個(gè)His及其周圍的氨基酸殘基都是很保守的。這些氨基酸都分布在含有兩對(duì)His的N末端區(qū)域，或是分布于C末端的Cys和其余結(jié)合銅離子的His之間［11］。

作者比對(duì)分析了14種漆酶的不同種屬來源的漆酶氨基酸序列后發(fā)現(xiàn)，有3處較為保守的氨基酸序列，為漆酶的4個(gè)銅離子結(jié)合區(qū)域。其中－HWHG－是漆酶最為保守的氨基酸序列，不僅相同種屬的這一序列同源性較高，且不同種屬來源的漆酶也包含這一保守區(qū)域。這些保守的銅離子結(jié)合區(qū)域決定了酶的活性位點(diǎn)以及催化位點(diǎn)。

將克隆得到的密孔菌基因序列翻譯成氨基酸序列后，與密孔菌屬其他3種菌株作了序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)－LTNHTMLKTTS－、－HWHGLFTNWADG－、－NQCPIASGHSFLYDF－在密孔菌屬的3種菌的氨基酸序列中還是比較保守的，推測(cè)這3處保守序列不僅與漆酶的蛋白質(zhì)的正確折疊有關(guān)，還與密孔菌屬特有的催化活性或者底物特異性有關(guān)。白腐菌產(chǎn)生的漆酶具有降解廢水中含酚化合物、苯氧基類除草劑和石油工業(yè)廢物等污染物的作用，可能與密孔菌屬特異的保守序列有關(guān)。PycnoporussanguineusSYBC－L1的穩(wěn)定性較好，不僅在p H 4.0～10.0的范圍內(nèi)能保持較高的活性，而且能夠在高溫和低溫下仍具有較好的催化活性。有機(jī)溶劑是通過介入酶蛋白的活性中心來影響酶的催化活性，PycnoporussanguineusSYBC－L1對(duì)于有機(jī)溶劑的耐受性也比較好。PycnoporussanguineusSYBCL1穩(wěn)定的酶學(xué)性質(zhì)是由它的基因序列決定的。

2.4 系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

采用軟件 Mega 5.0用鄰位相連法（neighborjoining，NJ）構(gòu)建進(jìn)化樹如圖7，可以看出，PycnoporussanguineusSYBC－L1在遺傳距離上與Trametesversicolor比較相近，而與Sporidiobolus salmonicolor較遠(yuǎn)。

對(duì)漆酶進(jìn)行克隆以及序列分析，最終的目的都是為了更好的實(shí)驗(yàn)基因的外源表達(dá)。而目前國內(nèi)外對(duì)于漆酶的研究上都是在真菌方面。因此，表達(dá)載體一般就是巴斯德畢赤酵母（Pichia pastoris）［12－15］和甲醇畢赤酵母［7，16］兩種，使得漆酶的異源表達(dá)研究面較窄。基于漆酶在生物降解，環(huán)境保護(hù)等方面的重要作用，實(shí)現(xiàn)漆酶的高效表達(dá)具有重要的價(jià)值和意義，所以進(jìn)一步加強(qiáng)對(duì)于漆酶分子水平的研究，使得漆酶更好地運(yùn)用在環(huán)保方面，能夠充分實(shí)現(xiàn)它的價(jià)值。

圖7 HJ法構(gòu)建擴(kuò)增漆酶基因系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.7 Neighbor－joining tree of the amplified sequence

（References）：

［1］王佳玲，余惠生.白腐菌漆酶的研究進(jìn)展［J］.微生物學(xué)通報(bào)，1998，25（4）：233－236.

WANG Gia－ling，YU Hui－sheng.The study progress on white rot fungi laccase［J］.Microbiology，1998，25（4）：233－236.（in Chinese）

［2］Hahn MG.Microbial elicitors and their receptors in plants［J］.Annu Bey Phytopathol，1996，34：387－412.

［3］Susana R C，Jose L T H.Industrial and biotechnological applications of laccase：A review［J］.Biotechnology Adcances，2006，24：500－513.

［4］楊建強(qiáng)，劉剛，湯國營，等.改構(gòu)的野生革耳漆酶基因在畢赤酵母中的表達(dá)和活性鑒定［J］.生物技術(shù)通訊，2005，16（3）：255－258.

YANG Jian－qiang，LIU Gang，TANG Guo－ying，et al.Expression and purfication of the modified gene of laccase from panus rudis inPichiapastoris［J］.Letters in Biotechnology，2005，16（3）：255－258.（in Chinese）

［5］堵國成，趙政，陳堅(jiān).真菌漆酶的酶活測(cè)定及其在織物染料生物脫色中的應(yīng)用［J］.江南大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2003，2（1）：83－90.

DU Guo－cheng，ZHAO Zheng，CHEN Jian.Assaying fungal laccase activity and its application in bio－decolorization of the texile dyes［J］.Journal of SouthernYangtze University：Natural Science Edition，2003，2（1）：83－90.（in Chinese）

［6］Giardina P，Annio R，Martirani L，et al.Cloning and sequencing of a laccase gene from the lignin－degrading basidiomycetePleurotusostreatus［J］.Appl－Environ－Microbiol，1995，61（6）：2408－2413.

［7］郭梅，蒲軍，杜連祥，等.雜色云芝漆酶（Lcc1）的克隆及在甲醇畢赤酵母中的表達(dá)［J］.菌物學(xué)報(bào)，2005，24（2）：221－226.

GUO Mei，PU Jun，DU Lian－xiang，et al.Cloning of cDNA encoding laccase（Lcc1）fromCoriolusversicolorand expression of the gene inPichiaMethanolica［J］.Mycosystema，2005，24（2）：221－226.（in Chinese）

［8］Guo L D，Hyde K D and Liew E C Y.Identification of endophytic fungi from Livistona chinensis based on morphology and r DNA sequences［J］.New Phytologist，2000，147：617－630.

［9］Brook J，F(xiàn)risch EF，Maniatis T.分子克隆實(shí)驗(yàn)指南［M］.北京：科學(xué)出版社，2002.

［10］張穎慧，魏東盛，邢來軍，等.一種改進(jìn)的絲狀真菌DNA提取方法［J］.微生物學(xué)通報(bào)，2008，35（3）：466－469.

ZHANG Yin－h(huán)ui，WEI Dong－sheng，Xing Lai－jun，et al.A modified method for isolating DNA from fungus［J］.Microbiology，2008，35（3）：466－469.（in Chinese）

［11］張敏，肖亞中，龔為民.真菌漆酶的結(jié)構(gòu)與功能［J］.生物學(xué)雜志，2003，20（5）：08－10.

ZHANG Min，XIAO Ya－zhong，GONG Wei－ming.Advances on the structure and function of fungal laccase［J］.Journal of Biology，2003，20（5）：8－10.（in Chinese）

［12］Colao M，Garzillo A，Buonocore V.Primary structure and transcription analysis of a laccase－encoding gene from the basidio－myceteTrametestrogii［J］.App l Microbiol Biotechnol，2003，63（2）：1532158.

［13］Kilaru S，Hoegger P J，KuesU.The laccasemulti2 gene family in Cop rinop sis cinerea has seventeen different members that divide into two distinct subfamilies［J］.Curr Genet，2006，50（1）：45－60.

［14］諶斌，唐雪明，沈微，等.粗糙脈孢菌漆酶基因的克隆及在畢赤酵母中的初步表達(dá)［J］.食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2006，25（4）：43－46，55.

CHEN Bin，TANG Xue－ming，SHEN Wei，et al.Cloning of a laccase gene from Neurospora crassaand it＇s preliminary expression inPichiapastoris［J］.Journal of Food Science and Biotechnology，2006，25（4）：43－46.（in Chinese）

［15］張銀波，江木蘭，胡小加，等.平菇漆酶基因在畢赤酵母中的分泌表達(dá)及酶學(xué)性質(zhì)研究［J］.微生物學(xué)報(bào)2005，45（4）：625－629.

ZHANG Yin－bo，JIANG Mu－lan，HU Xiao－jia，et al.Expression of a laccase gene fromPleurotusostreatusinPichiapastorisand characterization of the recombinant enzyme［J］.Acta Microbiologica Sinica，2005，45（4）：625－629.（in Chinese）

［16］周宏敏，洪宇植，肖亞中，等.栓菌漆酶在畢赤酵母中高效表達(dá)及重組酶的性質(zhì)［J］.生物工程學(xué)報(bào)，2007，23（6）：1055－1059.

ZHOU Hong－min，HONG Yu－zhi，XIAO Ya－zhong，et al.High output of aTrameteslaccase inPichapastorisand characterization of recombinant enzymes［J］.Chinese Journal of Biotechnology，2007，23（6）：1055－1059.（in Chinese）

Cloning and Sequencing Analysis of a Laccase Gene from Fungus

MAWen－yin1，CAIYu－jie＊1，LIAOXiang－ru1，HUYan1，LIZHI－ling2，ZH ANGDa－bing2
（1.Key Laboratory of Industrial Biotechnology，Ministry of Education，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；2.Hanbon Science ＆Technology Co.Ltd，Huaian 223001，China）

Effect of several different methods on the DNA extraction fromPycnoporussanguineuswere compared in this study.Degenerate primers were designed according to the fungal laccase condervation sequences which was registered on GenBank，.A 1084bp laccase gene fragment was amplified by using genomic DNA fromPycnoporussanguineusas template.According to the BLAST results，we found that the sequence presented a very high match with the laccase gene fromPycnoporusand shared considerable homology of above 99%.The alignment of amino acids shared considerable homology of above 88%.Therefore，the genomic DNA should be Pycnoporus.

laccase，cloning，sequence analysis，Pycnoporussanguineus

Q 814

A

1673－1689（2012）01－040－07

2011－01－23

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（21045007）；江蘇省科技創(chuàng)新與成果轉(zhuǎn)化（重大科技支撐與自主創(chuàng)新）專項(xiàng)引導(dǎo)資金項(xiàng)目（BY2010117）；科技部科技人員服務(wù)企業(yè)項(xiàng)目（2009GJ10038）。

＊

蔡宇杰（1973－），男，江蘇無錫人，工學(xué)博士，副教授，主要從事生物分離技術(shù)研究。Email：yu＿jie＿cai＠yahoo.com.cn