脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（DON）直接競爭ELISA方法的建立

張銀志， 金 萍，， 孫秀蘭＊，， 徐 丹， 邵景東

（1.食品科學與技術國家重點實驗室，江南大學，江蘇無錫 214122；2.江南大學食品學院，江蘇無錫 214122；3.張家港出入境檢驗檢疫局，江蘇 張家港 215500）

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（DON）直接競爭ELISA方法的建立

張銀志1， 金 萍1，2， 孫秀蘭＊1，2， 徐 丹2， 邵景東3

（1.食品科學與技術國家重點實驗室，江南大學，江蘇無錫 214122；2.江南大學食品學院，江蘇無錫 214122；3.張家港出入境檢驗檢疫局，江蘇 張家港 215500）

利用前期制備得到的DON酶標抗原（辣根過氧化物酶標記）以及抗DON抗體，建立檢測食品中DON含量的直接競爭ELISA方法。該方法的檢測范圍1～100 ng／m L，靈敏度達0.56 ng／m L，半數抑制濃度IC50為10 ng／m L；與DON類似物T－2毒素的交叉反應率為12%；玉米淀粉樣品回收率在80.2%～91.1% 之間，平均批間變異＜15%，平均批內變異＜3%。

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（DON）；酶標抗原；抗體；直接競爭ELISA；辣根過氧化物酶（HRP）

R 595.7

A

1673－1689（2012）01－028－05

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（DON）是單端孢霉烯族毒素之一，廣泛存在于谷物和飼料中，嚴重危害人類和動物的健康，DON可引起雛鴨、豬、貓、狗、鴿子等動物的嘔吐反應，其中豬對DON最為敏感［1］；Bosch［2］等對 DON 進行了小鼠體內實驗，研究表明DON可以引起實驗小鼠胃腸道出血、血尿甚至死亡。DON對熱穩定，一般的烹調及加工不能破壞其毒性，Scott［3］發現谷物經加工后制成寵物食品，其中仍能發現DON。鑒于DON對人畜的嚴重危害，我國要求動物飼料中的DON含量不得超過2 mg／kg，而人類消費品中的含量不得超過1 mg／kg［4］。

目前，檢測DON的方法很多，主要有生物學檢測法［5］、理化檢測方法［6－7］、免疫化學檢測法［8］。其中免疫化學檢測法具有特異性高、敏感性強、快速方便、以及不需要昂貴儀器設備等優點，在微量毒素的檢測中被廣泛應用。其中運用最廣的是酶聯免疫方法（ELISA），ELISA根據反應體系與檢測體系之間的關系可以分為直接法和間接法。現報道的DON的ELISA方法都是間接競爭ELISA，此方法雖然靈敏度高，但是精密度較差，且操作時間太長。相對而言，直接競爭ELISA操作簡便、耗時少，而且特異性強，具有更廣的應用前景。為了提高DON檢測的精密度及操作的時間，作者在前期試驗的基礎上利用已制備得到的DON酶標抗原以及抗DON抗體，建立了檢測食品中DON含量的直接競爭ELISA方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器或材料與設備

嘔吐毒素（DON）標準品：Alexis公司產品；嘔吐毒素（DON）酶標抗原：作者所在實驗室制備；抗嘔吐毒素（DON）抗體：作者所在實驗室自制；底物顯色液：江蘇省微生物研究有限公司產品；其他試劑均為國產分析純。MK3酶標儀：賽默飛世爾（上海）有限公司產品；微量移液器：德國梅特勒公司產品。

1.2 實驗方法

1.2.1 DON的直接競爭ELISA方法原理直接競爭ELISA方法測定原理見圖1。

圖1 直接競爭ELISA方法過程Fig.1 Process of direct competitive ELISA method

首先抗體吸附于固相載體上，然后加入待測樣品和相應酶標抗原，待測樣品／DON標準品、酶標抗原同時競爭固相載體上的抗體，當酶標抗原量一定時，待測樣品／DON標準品中DON含量越多，則被結合到抗體上的酶標抗原越少，發色反應就越弱，抑制率增高；反之，則發色反應增強，抑制率減低，從而可根據已知量DON的標準曲線和待檢樣品的抑制率，推算出待測物的濃度。

直接競爭ELISA法，其過程如下：

1）包被：以包被緩沖液（p H 9.6的碳酸鹽緩沖液）稀釋抗體包被酶標板，100μL／孔，4℃過夜或37℃反應2 h，洗滌3次，拍干；

2）封閉：1 g／d L BSA－PBS作封閉液，200μL／孔，37℃ 封閉1.5 h，洗滌3次，拍干；

3）加樣：先后加入DON標準品／樣品與酶標抗原各50μL，設空白對照，37℃孵育30 min；洗滌4次，拍干；

4）顯色：先后加入TMB底物顯色液a、b各50 μL／孔，37℃，15 min；

5）終止讀數：加入2 mol／L濃硫酸終止顯色反應，50μL／孔，用酶標儀測定其A450nm值。

1.2.2 最佳抗體包被濃度及酶標抗原濃度的篩選

分別將抗體與酶標抗原進行倍比稀釋，通過競爭棋盤實驗，選擇抑制率好且A450值在1.0～2.0之間時的抗體及酶標抗原濃度作為最佳條件［9］。

1.2.3 標準曲線的繪制及線性分析取標準DON質量濃度為0、0.01、0.1、0.5、1、2.5、5、10、20、50、100、200 ng／m L；以吸光度比值B／B0為縱坐標，100倍DON標準溶液的濃度的對數值為橫坐標擬合標準曲線。并進行標準曲線的線性分析［10］。

1.2.4 交叉反應率的測定以不同濃度的DON的近似物T－2毒素、NIV、ZEN、AFB1及LC－MR替代DON，按照ELISA進行測定分別得到各自的抑制濃度IC50′，以 DON 的IC50除以近似物的IC50′得到交叉反應率（IC50／IC50′×100%），根據交叉反應率的大小反映抗體的特異性［11］。

1.2.5 靈敏度的測定最低檢測限的測定方法［12］：測定陰性孔10次，計算陰性孔孔的平均值（）及標準方差（SD），以A值對應的DON濃度作為靈敏度，也稱為最低檢測限，計算公式為：

1.2.6 準確度的測定 準確度是指測定值與真值的符合程度，通常用加標回收率來表示［13］。選取嘔吐毒素較常存在的玉米粉做加標實驗。

具體方法：向未經處理的樣品中添加DON不同濃度的DON，對樣品進行處理后測定加標回收率。具體操作方法：準確稱取1.0 g粉碎均勻的樣品于三角瓶中，分別加入0、100、1 000 ng／m L的DON標準品各1.0 m L，每個濃度平行做3次。使樣品中

DON濃度分別為0、0.01、1 mg／kg，加入10 m L 體積分數10%甲醇提取液，振蕩10 min。以定量濾紙快速過濾，收集濾液，稀釋倍數為10。取適量濾液進行ELISA檢測分析。

1.2.7 精密度試驗 精密度［14］通常以批內和批間差異系數（CV）來表示。取0、10、100 ng／m L的

DON標準品，進行批內和批間差異試驗。批內差異試驗即在相同條件下，同時按ELISA法測定吸光值，每個濃度在測定中做4個平行，測定各濃度的變異系數（CV），取其算術平均值，即得平均批內變異系數；批間差異試驗即在連續3 d中，采用同一條件，每天測定1次，每個濃度測定2個平行，計算各濃度在不同時間測得數據的變異系數（CV），取其算術平均值，即得平均批間變異系數。

1.2.8 穩定性的測定穩定性是試劑盒的一個重要的評價指標，代表了試劑盒的貨架期，而穩定性主要是由抗體及酶標抗原的穩定性所決定的。酶及抗體很容易發生熱變性，從而導致檢測方法穩定性差。將板條置于37℃，7 d（37℃1 d相當于4℃ 兩個月），期間每天測定1次，通過計算各濃度點的結合率變化及曲線的相關系數確定方法的穩定性。1.2.9 與商品化試劑盒的比較 將自建的直接競爭酶聯免疫方法與商品化試劑盒的間接競爭方法從反應時間、方法靈敏度、準確度、精密度以及穩定性方面進行對比，進行進一步的評價。

2 結果與分析

2.1 最佳包被抗體濃度及酶標抗原濃度的確定

競爭棋盤法確定最佳包被抗體濃度及酶標抗原濃度，實驗數據見表1。

表1 棋盤試驗結果Tab.1 Results of chess board test

從表中數據可以看出酶標抗原質量濃度為25 μg／m L，抗體質量濃度為50μg／m L時數值適宜，抑制率最好，因此酶標抗原質量濃度為25μg／m L，抗體為50μg／m L作為最佳條件。

2.2 標準曲線的繪制及線性分析

在最佳包被抗體質量濃度及酶標抗原質量濃度下，取取標準DON質量濃度為0、0.01、0.1、0.5、1、2.5、5、10、20、50、100、200 ng／m L，按照直接競爭ELISA方法進行測定，以吸光度比值B／B0為縱坐標，100倍DON標準溶液的質量濃度的對數值為橫坐標擬合標準曲線，得到DON的競爭標準曲線，抑制曲線見圖2。

圖2 DON的抑制率曲線Fig.2 Inhibition curve of DON

由圖1可以得到，DON的質量濃度在1～100 ng／m L之間與B／B0有良好的線性關系。截取DON質量濃度在1～100 ng／m L之間，以吸光度比值B／B0為縱坐標，100倍DON標準溶液的濃度的對數值為橫坐標擬合標準曲線，得到線性回歸方程為：Y＝－0.296 9X＋1.399 6，R2＝0.995 5。以B／B0值接近50% 所對應的DON的濃度為IC50，在圖中，B／B0值接近50%時，DON的質量濃度為10 ng／m L，即所在實驗室所得IC50值為10 ng／m L。該值恰好位于標準曲線的線性區間上。

2.3 特異性的測定

ELISA檢測方法的特異性由交叉反應試驗來反映，作者研究了DON的結構類似物－T－2毒素以及其他真菌毒素：玉米赤霉烯酮（ZEN）、黃曲霉毒素B1（AFB1）、微囊藻毒素（MC－LR）對 DON的交叉反應率，交叉反應率均小于12%，說明該方法對于DON檢測特異性很好。

2.4 靈敏度的測定

2.5 精密度的測定

通過表2中數據計算得平均批內變異系數為2.82%；平均批間變異系數為14.54%。

2.6 準確度的測定

通過表3中數據計算得該方法對玉米粉的加標回收率在80.2%～91.1% 。

表2 批內、批間變異系數測定結果Tab.2 Intra－and inter－assay variation coefficients

表3 樣品添加回收率Tab.3 Recovery rate of DON in corn starch sample

2.7 穩定性試驗

37℃存放的試劑盒，在0.5 d后0孔吸光度值稍有下降，僅為6.9% ；1 d后曲線的相關系數也由0.979降至 0.968，0 孔吸光值下降 24.4%，但A450nm＞1，仍能滿足測定的需要；但當達到2 d時，0孔吸光值雖變化不大，但曲線已漂離，已不能用于測定。因此，推算此試劑盒能在37℃穩定1 d，及相當于4℃下2個月。結果見圖3。

圖3 試劑盒穩定性測定Fig.3 Stability of the kit

試劑盒穩定性由試劑盒中敏感試劑（抗體及酶標記物）決定，在儲存過程中酶標抗原酶活降低使曲線OD值呈現下降趨勢；而在2 d時曲線的飄離主要受抗體或酶標抗原變質的影響，下一步研究重點即是酶及抗體的保護。

3 結語

作者研制的脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（DON）的直接競爭ELISA檢測方法，工作條件為：DON酶標抗原（DON－HRP）為25μg／m L；抗DON抗體工作終濃度為50μg／m L。該方法的檢測范圍1～100 ng／m L，靈敏度達0.56 ng／m L，半數抑制質量濃度IC50為10 ng／m L；與DON類似物T－2毒素的交叉反應率為3%，與其他真菌毒素的交叉反應率也都小于12%；玉米淀粉樣品回收率在80.2%～91.1%之間，平均批間變異＜15%，平均批內變異＜3%。

我國規定谷物及其制品中DON的限量標準為1 mg／kg，作者建立的DON直接競爭ELISA方法的檢測范圍和靈敏度，均能滿足我國對小麥、玉米等谷物及其制品中DON的定量檢測。

（References）：

［1］Vesonder R F，Ciegler A，Burmeister H R.Acceptance by swine and rats of corn amended with trichothecenes［J］.Applied and Enviromental Micro－biology，1979，38（2）：334－336.

［2］Bosch U，Mirocha C J，Abbas H K，et al.Toxicity and toxin production byFusariumisolates from New Zealand［J］.Mycopathologia，1989，108：73－79.

［3］Young J C，Fulcher R G，Hayhoe J H，et al.Effect of milling and baking on deoxynivalenol（vomitoxin）content of eastern Canadian wheats［J］.J Agric Food Chem，1984，32（3）：659－664.

［4］中華人民共和國衛生部.小麥、面粉、玉米及玉米粉中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇限量標準［S］.GB16329－1996.

［5］陳懷谷，王永文，王裕中.應用赤霉毒素－芽鞘生測法鑒定小麥品種的抗赤霉病性［J］.江蘇農業科學，1990（6）：23－24.

CHEN Huai－gu，WANG Yong－wen，WANG Yu－zhong.Identification of wheat gibberellic disease by red mold toxin－bud scabbard biometric method［J］.Jiangsu Agricultural Science，1990（6）：23－24.（in Chinese）

［6］Childress W L，Krull I S，Selavka C M.Determination of deoxynivalenol in wheat by high performance liquid chromatography with photolysis in electrochemical detection（HPLC－HV－EC）［J］.Journal of Chromatographic Science，1990，28，（2）：76－82.

［7］Goyarts T，Danicke S.Bioavailability of the Fusarium toxin deoxynivalenol（DON）from naturally contaminated wheat for the pig［J］.Tociol Lett，2006，1；163（3）：171－82.

［8］Larsen J C，Hunt J，Perrin I，et al.Workshop on trichothecenes with a focus on DON：summary report［J］.Toxicology Letters，153 （1）：1－22.

［9］劉紅，曾振靈，楊桂香，等.恩諾沙星ELISA快速檢測方法的建立［J］.中國獸藥雜志，2006，40（11）：13－15.

LIU Hong，ZENG Zhen－ling，YANG Gui－xiang，et al.To establish the ELISA method for detecting enrofloxacin residues［J］.Chinese Journal of Veterinary Drug，2006，40（11）：13－15.（in Chinese）

［10］McCaughey WJ，Crooks S.Determination of sulfadimidine in animal feedstuffs by an enzyme－linked immunosorbent assay［J］.Food Additives and Contaminants，1990.7（2）：259－264.

［11］Mikhailov A H，Meriluoto J，et al.Production and specificity of mono and polyclonal antibodies against microcystins conjugated through N－methyldehydroalanine［J］.Toxicon，2001.39（4）：477－483.

［12］馮仁豐.分析靈敏度（檢測限）［J］.上海醫學檢驗雜志，2002，17：133－136.

FENG Ren－feng.Analytical enitivity（detection limit）［J］.Shanghai Journal o Medical Laboratory Sciences，2002，17：133－136.（in Chinese）

［13］高雷，黃飚，李秋萍，等.脫氧雪腐鐮刀烯醇時間分辨免疫法的建立［J］.食品科學，2009，30（20）：398－402.

GAO Lei，HUANG Biao，LI Qiu－ping，et al.Ultrasensitive Time－resolved fluoroimmunoassay of Deoxynivalenol［J］.Food Science，2009，30（20）：398－402.（in Chinese）

［14］韓丹，吳梅，鄧安平，等.酶聯免疫吸附分析法測定食品中的蘇丹紅Ⅰ號［J］.分析化學，2007，35（8）：1168－1170.

HAN Dan，YU Meng，WU Mei，et al.A Sensitive enzyme linked immunosorbent assay for the analysis of sudan I in food samples［J］.Chinese Journal of Analytical Chemistry，2007，35（8）：1168－1170.（in Chinese）

Establishment of the Direct Competition ELISA Method for Deoxynivalenol（DON）

ZHANGYin－zhi1，JINPing1，2，SUNXiu－lan＊1，2，XUDan2，SHAOJing－dong3

（1.State Key Laboratory of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；2.School of Food Science ＆ Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；3 Zhangjiagang Entry－Exit Inspection and Quarantine，Zhangjiagang 215500，China）

In this manuscript，the direct competition ELISA method for deoxynivalenol（DON）was established by using enzyme－labeled antigen of DON and antibody.It was found that the detection range of this method is 1～ 100 ng／m L，sensitivity 0.56 ng／m L，50%inhibitory concentration（IC50）10 ng／m L，the cross－reaction rate to DON analogues T－2 toxin 12%，the recoveries of corn starch samples 80.2%～91.1%.Moreover，the average intra－assay variation and the average inter－assay variation is less than 15%，and 3%，respectively.

deoxynivalenol（DON），enzyme－labeled antigen，monoclonal antibody，direct competition ELISA method，horseradish peroxidase

2011－01－23

國家自然科學基金資助項目（20806033）；張家港市科技局項目（ZKS0904）；2010年度公益性行業（農業）科研專項項目（201003008－08））。

張銀志（1975－），男，陜西漢中人，高級工程師，主要從事食品安全檢測研究。Email：yinzhizhang＠yahoo.com.cn

＊通信作者：孫秀蘭（1976－），女，山東聊城人，工學博士，副教授，主要從事食品安全研究。Email：sxlzzz＠yahoo.com.cn