糖尿病大鼠胰島B細胞損傷的形態(tài)定量研究*

文曉紅，郭 洋，向 宇，代小思，鄧世山

(川北醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，四川南充 637007)

在糖尿病的防治中,選擇適當(dāng)?shù)母深A(yù)措施保護殘存的胰島B細胞至關(guān)重要。目前，在運用鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)糖尿病動物模型進行胰島B細胞損傷的保護性藥物篩選方面的研究中，有關(guān)藥物治療后胰島B細胞數(shù)量能否恢復(fù)的研究報道較多[1-2]，但對胰島B細胞損傷后如果不采取任何干預(yù)措施，其數(shù)量隨著病程的延長能否自行恢復(fù)卻很少有研究報道。本實驗采用體視學(xué)形態(tài)定量研究方法，結(jié)合血清胰島素、空腹血糖測量等方法，探討胰島B細胞損傷后能否自行恢復(fù)，為胰島B細胞損傷的保護作用方面的研究提供更多的實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料 雄性SD大鼠，10～12周齡，體質(zhì)量280～320 g，由四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物研究所提供。STZ(瑞士ALEXIS公司)；ONETOUCH SureStep微血糖測量儀(中國強生醫(yī)療器材有限公司)；穩(wěn)步醫(yī)院用血糖試紙(美國LifeScan Inc)；RAT/MOUSE INSULIN ELISA KIT(美國LINCO Research)；抗胰島素抗體(一抗)及SABC免疫組化染色試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)；Olympus BX50型生物顯微鏡(日本Olympus公司)；體視學(xué)圖像系統(tǒng)(川北醫(yī)學(xué)院與北京馳馬特圖像技術(shù)有限公司及四川大學(xué)聯(lián)合研制)。

1.2動物分組及藥物注射 動物分2批進行實驗。第1批大鼠38只，隨機分為對照組9只，實驗組29只；第2批大鼠46只，隨機分為對照組10只，實驗組36只。自由攝取水和大鼠標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料。將STZ臨用前以0.1 mol/L(pH 4.2)的枸櫞酸-枸櫞酸鈉緩沖液溶解。在不禁食的條件下，實驗組按60 mg/kg一次性腹腔內(nèi)注射STZ；對照組一次性腹腔內(nèi)注射等量的緩沖液。

表1 對照組與實驗組的血糖、血清胰島素和形態(tài)定量結(jié)果±s)

1.3檢測指標(biāo) 在注射藥物前和注射后的第7天(第1批和第2批)和第84天(第2批)，給動物禁食、禁水7 h后測空腹血糖(剪尾取血，用微血糖測量儀及配套的血糖試紙，最大血糖值為27.8 mmol/L，更高的血糖值儀器顯示為H，這種情況血糖值被當(dāng)作為27.8 mmol/L)。在注射藥物后第7天(第1批)和第84天(第2批)，取血并分離血清，檢測血清胰島素(ELISA法，操作嚴(yán)格按試劑說明書進行，用Anthos2010酶標(biāo)儀采用雙波長測OD值，根據(jù)試劑說明給定的標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出相對應(yīng)的濃度值)。

1.4取材及標(biāo)本處理 在注射藥物后第7天(第1批)和第84天(第2批)，處死大鼠，取出胰腺置Bouin液內(nèi)浸潤固定，70%乙醇脫水，分離胰腺并稱質(zhì)量后，行組織塊等距隨機抽樣，每個胰腺共抽選4個組織塊；將4個組織塊放入一個包埋盒中用石蠟包埋；每個石蠟包埋塊切取5 μm厚的切片1張；進行胰島素免疫組織化學(xué)SABC法染色，操作嚴(yán)格按試劑盒說明書進行。

1.5形態(tài)學(xué)觀察與形態(tài)定量 使用Olympus BX50型生物顯微鏡和體視學(xué)圖像系統(tǒng)觀察切片，記錄胰島內(nèi)胰島素免疫組化陽性細胞(胰島B細胞)核的多少、大小和染色的深淺情況。用體視學(xué)方法測量以下指標(biāo)：(1)胰腺體積：胰腺的質(zhì)量除以胰腺密度1.021(胰腺的密度用已知濃度、比重的乙醇溶液測得)；(2)胰島總體積：胰腺體積乘以胰島的體積分?jǐn)?shù)即胰島的總體積[3]；(3)胰島總面積：每張切片隨機抽選胰島(不超過20個)，并利用測試系統(tǒng)軟件在圖像上隨機疊加12×13規(guī)則排列的156個測點(點間距25 μm×30 μm)，計數(shù)位于胰島內(nèi)的總測點數(shù)，胰島內(nèi)的總測點數(shù)乘以每一測點所關(guān)聯(lián)的測面面積(25 μm×30 μm)，就是胰島總面積；(4)單位面積胰島內(nèi)B細胞核數(shù)量(NA)：計數(shù)隨機抽選的胰島內(nèi)B細胞核的總個數(shù)，B細胞核的總個數(shù)除以胰島總面積即得單位面積胰島內(nèi)B細胞核數(shù)量。

2 結(jié) 果

2.1空腹血糖、血清胰島素 第1批大鼠的實驗組在注射STZ后第7天血糖達成模標(biāo)準(zhǔn)(血糖>11.1 mmol/L[4])的大鼠(成模7 d組)有7只；第2批大鼠的實驗組在注射STZ后第7天血糖達成模標(biāo)準(zhǔn)且成活至第84天的大鼠(成模84 d組)有8只。成模7 d組、成模84 d組及其正常對照組在注射藥物前和取材前的血糖以及血清胰島素見表1。

2.2形態(tài)學(xué)觀察與形態(tài)定量 對照組所有胰島內(nèi)B細胞數(shù)量多，占據(jù)胰島的大部分；胰島素表達強，胞質(zhì)內(nèi)含大量棕黃色顆粒；核的大小、形態(tài)一致(封3圖1)。成模組所有胰島內(nèi)B細胞數(shù)量減少；胰島素表達明顯減弱，細胞內(nèi)胰島素顆粒染色深淺有較大差異；有的B細胞核直徑增大(封3圖2)。成模7 d組、成模84 d組及其正常對照組的胰腺體積、胰島總體積、胰島總面積、B細胞核的總數(shù)和單位面積胰島內(nèi)B細胞核數(shù)量(NA)見表1。

3 討 論

胰島B細胞的再生主要包括：(1)B細胞增生：主要來自成體干細胞或前體細胞，胚胎發(fā)育晚期及新生期是B細胞增生的高峰期，成年后只有當(dāng)胰島受到嚴(yán)重?fù)p傷或在大量GLP-1刺激下，干細胞才有可能分化為B細胞。(2)B細胞自我復(fù)制：出生以后B細胞數(shù)量的維持主要是已有B細胞的復(fù)制和凋亡之間的平衡[5]。目前，人們關(guān)心的是藥物治療后糖尿病動物胰島B細胞數(shù)量能否恢復(fù)，但對胰島B細胞損傷后如果不采取任何干預(yù)措施，其數(shù)量隨著病程的延長能否自行恢復(fù)的報道少。如有研究表明新生大鼠或胎鼠的胰島B細胞損傷后能夠部分恢復(fù)[6-7]，另有研究報道，成年大鼠注射STZ后，隨著糖尿病病程的推進,通過形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)胰島B細胞進一步減少，到6個月時許多胰島內(nèi)只殘留2～3個B細胞,有的甚至缺如[8-9]。

本實驗通過體視學(xué)形態(tài)定量研究表明，與對照組比較，糖尿病成模大鼠在注射STZ后第7天(成模7d組)的胰島總體積、胰島總面積、B細胞核的總數(shù)、單位面積胰島內(nèi)B細胞核數(shù)量和血清胰島素分別減少了75%、52%、90%、73%和67%(P<0.05)，空腹血糖升高了194%(P<0.05)；第84天(成模84d組)的胰腺體積、胰島總體積、胰島總面積、B細胞核的總數(shù)、單位面積胰島內(nèi)B細胞核數(shù)量和血清胰島素分別減少了13%、89%、76%、94%、79%和92%(P<0.05)，空腹血糖升高了350%(P<0.05)，說明成模大鼠的胰島B細胞已受到嚴(yán)重的損傷，分泌胰島素的功能明顯降低，空腹血糖明顯升高。而成模大鼠的胰腺體積、胰島總體積、胰島總面積、B細胞核的總數(shù)和單位面積胰島內(nèi)B細胞核數(shù)量在第7天和第84天差異均無統(tǒng)計學(xué)意義；形態(tài)學(xué)觀察在第7天和第84天也無明顯區(qū)別；血清胰島素在第84天比第7天減少了71%(P<0.05)；空腹血糖在第84天比第7天升高了30%(P<0.05)，說明成模大鼠的胰島B細胞受到嚴(yán)重的損傷后，如果不

采取干預(yù)措施，隨著病程的延長，雖然有新的B細胞形成，但B細胞的自我復(fù)制不足以補償其數(shù)量的減少，故B細胞數(shù)量不能自行恢復(fù)，空腹血糖也沒有出現(xiàn)自發(fā)性緩解的現(xiàn)象。

另外，本實驗還發(fā)現(xiàn)，正常成年雄性大鼠胰島總體積在11～13周齡時為(6.06±1.62)μL3，而到24～26周齡時增長為(10.3±3.47)μL3，增長了70%(P<0.05)，說明胰島總體積隨著動物的年齡增加而增長；正常成年雄性大鼠B細胞核的總數(shù)在11～13周齡時為(229±74)個，而到24～26周齡時增加到(350±143)個，增加了53%(P<0.05)，但同時胰島總面積也增加了82%(P<0.05)，故單位面積胰島內(nèi)B細胞核數(shù)量在11～13周齡時和24～26周齡時差異無統(tǒng)計學(xué)意義，說明單位面積胰島內(nèi)B細胞數(shù)量不隨動物的年齡而增加，推測可能是在非糖尿病狀態(tài)下B細胞再生與凋亡處于動態(tài)平衡所致。

綜上所述，給大鼠一次性注射大劑量STZ(60 mg/kg)后，成模大鼠的胰島B細胞受到嚴(yán)重的損傷，如果不采取干預(yù)措施，隨著病程的延長，B細胞數(shù)量不能自行恢復(fù)，空腹血糖也就一直處于高血糖水平。

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