抗痛風膠囊治療大鼠急性痛風性關節炎及下調TNF-α水平*

于 泓，袁良東#，鐘正霞，姚觀平，余麗梅，徐尚福，吳 芹

(1.遵義醫學院附屬醫院腎內科 563003;2.遵義醫學院附屬醫院貴州省細胞工程重點實驗室 563003；3.遵義醫學院貴州省基礎藥理重點實驗室，貴州遵義 563003)

痛風是嘌呤代謝障礙引起的代謝性疾病，其臨床主要表現為高尿酸血癥、急性關節炎反復發作、痛風石沉積、慢性關節炎和關節畸形及功能障礙、腎實質退行性病變甚至尿毒癥。隨著人們生活水平的不斷提高，飲食結構和生活習慣的改變，其發病率呈上升趨勢，已成為危害人類健康的常見病。目前，主要采用秋水仙堿等控制急性痛風性關節炎(acute gouty arthritis，AGA)發作癥狀，但復發率高,發癥難控制，治療藥物不良反應較大[1-4]。

尿酸結石導致關節炎癥反應發生是AGA發病的主要機制之一，腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白介素-1β(IL-1β)和白介素-6(IL-6)等炎癥因子是引起關節炎癥反應的關鍵因子，從而導致關節的紅、腫、疼痛。秋水仙堿、糖皮質激素等通過減少炎性介質生成或阻斷炎性因子作用，從而緩解AGA臨床癥狀[5]。

抗痛風膠囊(anti-gout capsule，AGC)以祛風通絡的中醫學理論為基礎配制而成，由烏梢蛇、桃仁、紅花、枸杞、木瓜、桂圓等中藥組成，民間用于治療AGA，緩解關節炎癥及疼痛效果顯著。本研究主要在評價抗痛風膠囊治療AGA療效的同時，檢測TNF-α在AGA大鼠血清、關節液和關節組織中的變化情況，探討抗痛風膠囊的抗炎作用機制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1藥物與試劑 AGC由遵義醫學院附屬醫院腎內科提供，0.5 g/粒；秋水仙堿(西雙版納版納藥業有限責任公司生產)，每片0.5 mg(批號 20100502)。尿酸鈉結晶(批號 100982303)購于美國Sigma公司， TNF-α ELISA檢測試劑盒購于上海西唐生物科技有限公司。吐溫80等其他化學試劑均為國產分析純產品。

1.1.2主要儀器 YLS-TA型足爪容積測量器購于山東省醫學科學院設備站，通用酶標儀和KDC-2044低速冷凍離心機分別為美國BIO-RAD公司和科大創新股份有限公司產品。

1.1.3動物 健康雄性SD大鼠50只，體質量240～250 g,第三軍醫大學大坪醫院實驗動物中心提供，SPF級動物合格證號 SEXK(渝)2007-00050。實驗前適應性飼養5 d。

1.2方法

1.2.1實驗分組 大鼠稱體質量、編號，隨機分為5組，每組10只，即空白組、模型組、陽性藥物組、AGC低劑量、AGC高劑量組。于造模前、后測量大鼠足爪容積，每天測量1次；制備AGA模型同時，每天灌胃給藥一次，連續5 d，空白組和模型組給予等容積(1 mL/100 g)生理鹽水，陽性藥物組給予秋水仙堿0.8 mg/kg，AGC組則分別給予AGC 0.3 g·kg-1·d-1、1.2 g·kg-1·d-1。第5天灌胃2 h后處死大鼠，留取標本，-80 ℃低溫冰箱保存待用。

1.2.2AGA大鼠模型制備[6-7]除空白組外，其余大鼠均腹腔注射10%水合氯醛0.3 mL/100 g麻醉，仰臥位固定，右踝關節局部消毒，以其外側后方為穿刺點，穿刺進入踝關節腔，向關節腔注入0.2 mL尿酸鈉溶液(尿酸鈉結晶250 mg加0.9%氯化鈉注射溶液45 mL，再加5 mL吐溫80，加熱攪拌，配制成尿酸鈉溶液50 mL)，以關節囊對側鼓起為注入標準?？瞻捉M注射等容積生理鹽水。

1.2.3步態行為學評分[8]觀察模型制備后24～48 h AGA大鼠步態變化。評分標準：0分為正常步態；1分為輕度跛行，受試下肢略彎曲；2分為中度跛行，受試下肢剛觸及地面；3分為重度跛行，受試下肢離開地面，三足著地行走。

1.2.4關節容積測定 實驗前與AGC治療前后，用足趾容器測量大鼠足趾容積，以反應足踝關節容積，連續監測大鼠關節容積的變化。

1.2.5TNF-α含量測定 AGA大鼠連續灌胃給藥治療5 d處死，取腹主動脈血2 mL，離心、分離血清，備用。另在踝關節上方0.5 cm處剪下含踝關節的足爪，去皮膚后足爪縱切，放入5 mL生理鹽水，4 ℃浸泡過夜，留取上清液1 mL。按照試劑盒說明書，采用ELISA法測定光密度值，按標準曲線計算血清和關節液中TNF-α含量。

2 結 果

2.1一般狀態 實驗期間可見空白組和AGC組大鼠皮毛白而光澤。反應靈敏，飲食及尿便正常。模型組精神、飲食尚可,大小便正常，但體毛稍欠光澤，秋水仙堿組大鼠體毛欠光澤，精神欠佳，懶動，食量減少，少數大鼠出現大便稀溏。

2.2AGC對大鼠步態變化的影響 與空白組比較，模型組大鼠步態評分值明顯升高(P<0.01)，活動減少，右下肢彎曲，行走時出現不同程度的跛行，以模型制備后24～48 h變化明顯。與模型組比較，秋水仙堿組和AGC各組大鼠活動狀態得到顯著改善，評分顯著降低(P<0.01)，見表1。

表1 AGC對大鼠步態變化的影響

表2 AGC對大鼠關節容積的影響

表3 AGC對大鼠血清TNF-α含量的影響

2.3AGC對大鼠關節腫脹度的影響 以足趾容積變化反應踝關節容積，其值增加表示關節腫脹度增大，結果可見，除空白組外，注射尿酸鈉結晶各組，1～5 d，大鼠的踝關節容積均明顯高于注射前水平(P<0.01)，存在不同程度的關節腫脹，且關節腫脹度隨時間延長，有不同程度的減輕(表2)。與空白組比較，模型組大鼠關節容積顯著增加(P<0.01)。與模型組比較，AGC低、高劑量組和秋水仙堿組關節容積均明顯降低，但仍高于治療前水平。

表4 AGC對大鼠關節液中TNF-α含量的影響

2.4AGC對大鼠血清和關節液中TNF-α含量的影響 給藥治療5 d，TNF-α含量測定結果顯示，與空白組比較，模型組大鼠血清和關節液中TNF-α含量均明顯升高(P<0.05)，經秋水仙堿和低、高劑量AGC治療后，與模型組比較，AGA大鼠血清和關節液中TNF-α含量明顯降低(表3、4)，且抗痛風膠囊與秋水仙堿組TNF-α含量無顯著差異。

3 討 論

大鼠后足踝關節注射尿酸鈉結晶制備AGA模型，已被廣泛用于痛風性關節炎治療藥物的研究，所引起的癥狀和病理變化與人體AGA的臨床表現極為相似[9]，TNF-α、IL-1β等炎性因子參與了尿酸鈉誘導的關節組織免疫炎癥反應[10-12]。一般認為中性粒細胞、內皮細胞黏附是急性痛風產生的本質，而TNF-α等可上調內皮細胞選擇素活性，增加中性粒細胞的募集，使內皮細胞和中性粒細胞表面的黏附分子相結合，浸潤關節部位，釋放炎性介質，引起關節局部炎癥反應的發生。因而降低AGA患者關節局部TNF-α水平，可減少或終止炎性因子的惡性循環，是AGA治療的有效措施之一。TNF-α水平的變化既可能反應關節炎癥反應的輕重，也是AGA發病的機制，已被用于治療痛風藥物療效評價的重要檢測指標之一[13-15]。此外，TNF-α還可通過誘導前列腺素等致痛物質釋放，產生致痛效應。因而減少局部的TNF-α，也可一定程度地緩解局部疼痛。

本實驗中，大鼠注射尿素鈉結晶24～48 h，已出現明顯的踝關節紅、腫及步態異常，與文獻報道一致[9]，產生了AGA的癥狀和體征，表明AGA模型制備成功。給予AGC和秋水仙堿治療后48 h，AGA大鼠踝關節腫脹程度已開始減輕，大鼠步態也有所改善，治療5 d，上述癥狀基本消除，關節腫脹程度也減輕70%～90%。表明AGC和秋水仙堿對尿素鈉結晶引起的AGA具有明顯治療作用。有研究報道[16]，AGC中的烏梢蛇具有祛風、通絡止痙，烏梢蛇體富含的烏梢蛇Ⅱ型膠原蛋白，可明顯抑制滑膜細胞炎性因子的水平和活性；木瓜、桃仁等則具有抗血凝、溶栓、解熱鎮痛等作用[17-18]，上述藥物的共同作用，可能是AGC對AGA產生良好治療作用的基礎。

AGA模型組大鼠血清和關節液中TNF-α含量明顯升高，說明循環和局部TNF-α水平的升高與AGA的發病關系密切，是重要致炎因子。AGC在迅速緩解AGA大鼠關節腫脹的同時，還將異常增高的血清和關節液TNF-α水平降至正常范圍，表明下調循環和關節局部TNF-α水平是AGC發揮治療作用的主要機制之一，從而有效阻斷TNF-α引起的炎癥瀑布級聯及網絡效應，明顯減輕關節局部的炎癥反應和關節損傷。然而，AGC是否還可調節IL-1β等其他炎性因子的水平，或通過其他途徑減輕關節損傷，還需要進一步深入研究。

總之，AGC可迅速緩解AGA大鼠踝關節的腫脹，改善其步態異常，其作用機制與顯著降低血清和關節液中TNF-α的含量，減少炎癥損傷有關。

[1]勞志英.原發性痛風關節炎的診斷和藥物治療[J].中國新藥與臨床雜志，2004,23(9):632-634.

[2]So A.Developments in the scientific and clinical understanding of gout[J].Arth Res Ther,2008,10:221-226.

[3]Mikuls TR,Saag KG.Gout treatment:what is evidence-based and how do we determine and promote optimized clinical care?[J].Current Rheumatology Reports,2005,7(3):242-249.

[4]張忠輝.痛風與高尿酸血癥的進展[J].重慶醫學，2007,36(10):985-988.

[5]薛耀明,李晨鐘.痛風的診斷與治療[M].2版.北京:人民軍醫出版社,2006:231.

[6]時樂,徐立.痛風性關節炎動物模型的研究現狀與展望[J].中國實驗動物學報,2006,14(1):71-74.

[7]黃曉巍,張永和,周鳴.痛風安膠囊對尿酸鈉痛風模型動物關節炎反應的影響[J].中華中醫藥學刊,2007,25(10):2114-2115.

[8]馬穎,顏海燕,劉梅,等.雞矢藤提取物對尿酸鈉晶體誘導大鼠急性痛風性關節炎影響的研究[J].中國藥房,2008,19(6):411-414.

[9]張昱.痛風[M].北京:科學技術文獻出版社,2006:2120-2122.

[10]Liu-Bryan RL,Scot P,Sydlaske A,et al.Innate immunity conferred by toll - like receptors 2 and 4 and myeloid differentiation factor 88 expression is pivotal to monosodium urate monohydrate crystal - induced inflammation[J].Arthritis Rheum，2005,52(9):2936-2946.

[11]So A,Smedt TD,Revaz S,et al.A pilot study of IL-1 inhibition by anakinra in acute gout[J].Research & Therapy，2007,9(2):R28.

[12]di-Giovine FS,Malawista SE,Thornton E,et al.Urate crystals stimulate production of tumor necrosis factor alpha from human blood monocytes and synovial cells Cytokine mRNA and protein kinetics,and cellular distribution[J].J Clin Invest，1991,87(4):1375-1381.

[13]Chen CJ,Shi Y,Hearn A,et al.My D88-dependent IL-1 receptor signaling is essential for gouty inflammation stimulated by monosodium urate crystals[J].J Clin Invest，2006,116(8):2262-2271.

[14]陳文照,谷煥鵬,溫成平.痛風寧對尿酸鈉致大鼠關節炎滑膜IL-1β、TNF-α含量的影響[J].中國醫藥學報,2004,19(2):93-94.

[15]惠扔華,姜宏,吳士良.痛風平對大鼠實驗性急性痛風性關節炎IL-1β、TNF-α和MP-1的影響[J].中醫正骨，2006,18(3):8-9.

[16]龐捷,李娟,吳湘慧.烏梢蛇 Ⅱ型膠原蛋白對大鼠佐劑型關節炎滑膜細胞因子的作用[J].中藥材，2009，32(4):556-560.

[17]任貽軍,張宏琳.木瓜苷的藥理作用[J].中醫中藥,2009,3(下):50-51.

[18]胡烈.薏苡仁臨床新用舉隅[J].中國臨床醫生，2001,29(10):54-55.