光激化學發光免疫分析法測定低濃度HBsAg效果評價

陳桂蘭，陸 燕

(廣西壯族自治區來賓市人民醫院檢驗科 546100)

HBsAg為HBV感染的最主要病原標志和直接證據之一,目前中國大多數實驗室采用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)及膠體金法進行檢測，對于HBsAg低濃度的標本，檢測時常因方法學的原因造成靈敏度較低,導致臨床出現漏檢等問題。光激化學發光免疫分析法(light initiated chemiluminescence assay,LICA)始于20世紀90年代問世的單線態氧分子能量傳遞發光免疫分析技術(luminescent oxygen channeling immunoassay，LOCI)，經過長時間的發展，國內已成功研制了基于LOCI檢測原理的LICA及檢測設備和相關試劑。本文使用LICA、ELISA及膠體金法同時測定經電化學發光免疫分析法(ECLIA)篩選的HBV定量檢測陽性膠體金法標本吸光度與儀器所給臨界值(Cut-off)的比值(COI)為1～50的臨床標本80例,HBsAg COI<1的臨床標本30例作為陰性對照，以廣西壯族自治區臨檢中心提供的臨界值控制品作為質控，現將評價效果報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 80份經羅氏ECLIA篩選HBsAg COI 為1～50的低濃度臨床標本來自本院門診及住院患者(觀察組)，乙型肝炎(簡稱乙肝)患者診斷符合國家標準。30份正常人血清來自本院健康體檢者(對照組)。

1.2方法

1.2.1儀器及試劑 LICA HT 高通量免疫分析儀、LICA SP 全自動移液器以及試劑盒由上海博陽生物科技(上海)有限公司提供；羅氏COBAS e601電化學發光分析儀及配套試劑由瑞士羅氏公司提供；ELISA HBsAg試劑盒由英科新創(廈門)公司提供,Biocell- 2010酶標儀由博賽公司提供、BIO-RAD 1575洗板機由伯樂公司提供；膠體金法試劑由杭州艾康公司提供。廣西壯族自治區臨檢中心提供的臨界值控制品濃度為1 ng/mL。標準品為美國Abbott公司提供，血清定值為HBsAg 1 ng/mL。

1.2.2測定方法 (1) LICA測定HBsAg的含量采用雙抗體夾心法，基礎原理是一種均相免疫反應：均相條件下，將試劑1(R1，內部帶有染料的納米感光微粒)、試劑2(R2，內部帶有發光化合物、包被有活性分子的納米發光微粒)與待測樣本進行混合。此時R1中的感光微粒和R2中的發光微粒可快速有效地捕捉待測物質，形成免疫復合物。復合物經過680 nm激發光照射后，感光微粒中的染料被誘導激活，并釋放出高能態的單線態氧，而單線態氧能被近距離(200 nm)的發光微粒所俘獲，發光微粒進而釋放出高能級的紅光(610 nm)，通過單光子計數器和數學擬合將光子數換算為靶分子濃度。當樣本不含待測物質時，兩種微粒間則無法形成免疫復合物，單線態氧在液相中迅速衰減，無法傳遞至發光微粒表面，檢測時則無光子產生。(2) 羅氏ECLIA全自動儀器操作按照廠家說明書及科室的儀器標準操作程序(SOP)文件規定進行。(3) ELISA法嚴格按照廈門英科新創公司提供的說明書進行。(4) 膠體金法嚴格按艾康公司提供的說明書進行。

1.2.3結果判斷標準 按照試劑盒說明，LICA>0.2 ng/mL可判斷為陽性，ECLIA COI>1可判斷為陽性，ELISA當OD/CO>1可判斷為陽性，膠體金法出現2條帶時可判斷為陽性。

1.2.4評價方法 (1)靈敏度比較：標準品(HBsAg濃度1 ng/mL)用PBS-BSA液倍比稀釋至0.5、0.25、0.12、0.06、0.03 ng/mL等已知濃度系列樣品，分別使用LICA、ECLIA、 ELISA及膠體金法重復測定2次，比較各方法間的靈敏度。(2)精密度比較：對處于臨界值的質控品連續檢測5 d。每天2批，每批各重復5次，計算平均批內變異系數(CV)。由于膠體金法僅判斷為陽性、弱陽性和陰性，本文對膠體金法的精密度不進行討論。(3)4種方法檢測HBsAg的比較：以ECLIA為比較對象，分析LICA、ELISA和膠體金法檢測兩組的樣本，比較檢出率和符合率。

1.3統計學處理 采用SPSS15.0統計軟件進行分析，對ECLIA、LICA和ELISA 3種方法檢測HBsAg的結果采用配對χ2檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.14種檢測方法測定HBsAg的靈敏度比較 HBsAg濃度為0.12 ng/mL 時ECLIA為陽性(COI>1)；HBsAg濃度為0.25 ng/mL時LICA為陽性；HBsAg濃度為0.50 ng/mL時ELISA為陽性(OD/CO>1)；HBsAg 濃度為1.00 ng/mL 膠體金法為陽性(試紙條出現2條紅色帶時)。見表1。

表1 4種方法測定HBsAg的靈敏度比較(ng/mL)

2.2ECLIA、LICA和ELISA 3種方法的CV比較 ECLIA、LICA和ELISA平均濃度分別為7.11±3.69(COI)、(1.08±0.57 )ng/mL和4.56±2.24(OD/CO)，CV分別為7.8%、8.6%和11.9%。

2.34種方法測定HBsAg結果比較 4種方法檢測兩組樣本，以ECLIA法作比較，其中LICA檢出率為98.7%，ELISA 法檢出率為93.7%，膠體金法檢出率僅為25.0%，見表2。

表2 4種方法HBsAg測定結果比較

3 討 論

HBsAg是檢測HBV首選的免疫學標志物，膠體金法和ELISA兩步法檢測HBsAg，在國內已被廣泛采用，ELISA兩步法雖在一定程度上能杜絕鉤狀效應(Hook效應)，但同時也可因靈敏度較低(<0.5 ng/mL)而出現漏檢，而且ELISA方法由于要分離結合態的抗原(或抗體)與游離態的抗原(或抗體)，因此需要反復加樣和洗板，引入的誤差加大，加上酶標板的孔間存在差異等問題一直導致該法精密度較差。本次結果中，ELISA法的CV是11.9%，分析原因可能是由于選用了較低值的質控品(1 ng/mL)進行評價；對于低濃度的HBsAg標本(COI 1～50)，也因為方法靈敏度較低而出現假陰性[1]，本實驗中出現5例假陰性；膠體金法雖然操作簡單、方便，但由于其方法學的原因靈敏度更低，同樣對低濃度HBsAg檢測會產生假陰性結果[2]。

而ECLIA是近年來繼熒光免疫法(FIA)、放射免疫法(RIA)和酶聯免疫法(EIA)之后發展起來的新興免疫標記技術，該技術使用的標記物穩定，無放射性污染，已發展成為國外檢測病毒性肝炎血清學指標的重要方法[3]。與ELISA和膠體金法比較，ECLIA試劑的優勢在于其不僅具有較高的靈敏度，而且還具有更寬的線性范圍[4-5]。但是該方法所需儀器和試劑成本較高,不適宜在基層地方推廣。

LICA技術使用了納米級顆粒，增加了生物分子的包被面積，同時借助鏈霉親和素-生物素放大系統，極大地提高了檢測靈敏度，減少樣本和試劑的用量，它避免了傳統檢測方法中繁瑣的分離和洗滌步驟，有效降低了檢測背景值，減少了反應時間，并可實現自動化操作[1,6-7]。目前還沒有應用該原理的進口試劑，而國內已經研制了與該方法配套的檢測病毒性肝炎標志物和相關腫瘤標志物的全自動檢測系統。本文使用LICA對HBsAg的檢測結果顯示，LICA對HBsAg的分析靈敏度可達到0.25 ng/mL，80例陽性樣本中僅1例未檢出，與ECLIA測定結果最為相近。

本文對80例HBsAg低濃度標本檢測結果顯示，ELISA與膠體金法的漏檢率為6.3%和75.0%，對低濃度樣品易漏檢，且無法得知被測物真正的濃度，給臨床診斷和治療帶來許多不便。HBV血清標志物定量檢測能較為準確地反映其血清中的含量，對臨床藥物療效評價具有重要意義[8]。而LICA和ECLIA均可對HBsAg進行定量。本實驗中LICA和ECLIA檢出相符性很高，兩種方法檢測結果的符合率高達99.09%，對HBsAg的陽性率差異無統計學意義(P>0.05)，表明使用LICA可以在常規臨床檢測中替代ECLIA用于HBsAg定量檢測。雖然對普通人群進行初篩時，檢測方法使用高靈敏度方法進行檢測是否存在醫療過度的問題尚存在爭議，但由于LICA已經實現了儀器和試劑的國產化，成本較低，可以有效降低醫療費用。與ECLIA相比，LICA具備相近的檢測性能，但可控制成本；與ELISA及膠體金法比較，LICA具有更高的敏感度并可簡化操作步驟，使實驗更快捷，且該法可進行自動化定量檢測，可動態觀察療效和監測病情，適于臨床使用。

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