參芪化淤方對H22肝癌細(xì)胞survivin表達(dá)的影響

蘇 宏，葉江琳，劉 慧，梁曉海

(廣州中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院內(nèi)科 510360)

肝癌是我國常見的惡性腫瘤，由于較多肝癌患者在確診時(shí)已經(jīng)失去了手術(shù)治療的最佳機(jī)會(huì)，多采用藥物治療。隨著人們對中醫(yī)藥深入研究，其在治療腫瘤方面的獨(dú)特優(yōu)勢越來越受到人們的重視。癌基因、抗癌基因及凋亡基因?qū)τ趷盒阅[瘤的發(fā)生和發(fā)展起著至關(guān)重要的作用。Survivin作為凋亡抑制蛋白家族中的最小成員，具有抑制細(xì)胞凋亡和調(diào)節(jié)細(xì)胞分裂、促進(jìn)細(xì)胞增殖的雙功能蛋白，是迄今發(fā)現(xiàn)最強(qiáng)的凋亡抑制因子。能夠?qū)笹2/M期細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用，促進(jìn)通過細(xì)胞調(diào)定點(diǎn)，從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。參芪化淤方是本課題組在臨床上用于治療原發(fā)性肝癌的經(jīng)驗(yàn)方，臨床應(yīng)用取得了較好的療效，前期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果已提示參芪化淤方對荷瘤小鼠H22肝癌細(xì)胞有一定程度抑制作用。臨床研究提示參芪化淤方口服可減輕介入治療所致肝功能損害，減輕化療藥物毒副反應(yīng)。但其治療腫瘤的確切機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。本課題通過觀察荷瘤鼠腫瘤組織survivin基因的表達(dá)，探討參芪化淤方對H22肝癌細(xì)胞作用影響的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 NIH小鼠：健康SPF級，60只，雌雄各半，體質(zhì)量18～22 g，由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)：SCXK(粵)2008-0002。飼養(yǎng)環(huán)境：普通級動(dòng)物飼養(yǎng)室，每只小鼠均在相同條件下，溫度20～26 ℃，相對濕度60%～80%，自由飲水、攝食，保持自然光照。

1.1.2實(shí)驗(yàn)藥材 參芪化淤方：黨參25 g、北芪25 g、白術(shù)15 g、淮山15 g、丹參15 g、丹皮10 g、生牡蠣30 g(先煎)、莪術(shù)10 g、蜈蚣2條、蛇舌草15 g、炙甘草6 g。

1.1.3實(shí)驗(yàn)試劑 H22肝癌細(xì)胞株由中國醫(yī)學(xué)院藥物研究所提供，環(huán)磷酰胺(CTX)注射用粉針劑購自山西普德藥業(yè)有限公司(批號(hào)：20100206，200 mg/支，臨用前用生理鹽水溶解稀釋濃度為2 mg/mL)，10%中性甲醛溶液購自上海銳谷生物有限公司，無水乙醇、30%過氧化氫(H2O2)溶液、二甲苯購自廣州化學(xué)試劑廠，兔抗鼠survivin免疫組化單克隆抗體購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，0.01 mol/L PBS、0.01 mol/L檸檬鹽緩沖液(CB)、生物素化山羊抗兔IgG、辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液(S-A/HRP)、DAB顯色試劑盒均購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.1.4儀器與設(shè)備 電熱恒溫水浴箱購自環(huán)宇科學(xué)儀器廠，切片機(jī)購自德國Leica公司，生物組織包埋機(jī)(TB-718)、智能程控生物組織自動(dòng)脫水機(jī)(TC-120S型)購自湖北泰維醫(yī)療科技有限公司，電子天平(MP200A)購自天津精密科學(xué)儀器有限公司，超低溫冰箱購自美國Thermo公司，光學(xué)顯微鏡(MZS065-R)由廣州中醫(yī)藥大學(xué)病理實(shí)驗(yàn)室提供；移液槍(2、10、50、200 μL)購自德國Eppendorf公司，微波爐購自美的股份有限公司。

1.2方法

1.2.1H22肝癌荷瘤小鼠模型建立 于液氮罐中取出H22肝癌細(xì)胞株1支，置于37 ℃電熱恒溫水浴箱內(nèi)，輕輕搖動(dòng)使其盡快融化。取出凍存管，用乙醇消毒后開啟，用吸管吸出細(xì)胞懸液，注入離心管并滴加10%小牛血清RPMI1640培養(yǎng)基，常規(guī)離心，制成瘤細(xì)胞混懸液,臺(tái)盼藍(lán)計(jì)數(shù)約1×107個(gè)/mL瘤細(xì)胞。取0.2 mL(約1×106～2×106個(gè)瘤細(xì)胞)接種于小鼠腹腔。經(jīng)3次細(xì)胞傳代培養(yǎng)后，消毒鼠腹在無菌條件下，抽取乳白色腹水為瘤源，加生理鹽水制成瘤細(xì)胞混懸液,接種于50只NIH小鼠右前肢腋窩皮下，每只0.2 mL(約1×107個(gè)瘤細(xì)胞)。

1.2.2藥液制備 參芪化淤方由廣州中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院制劑室經(jīng)水煎、濃縮及醇沉制成濃縮溶液，分低、中、高劑量組，各組藥物濃度根據(jù)人、動(dòng)物體表面積與計(jì)量換算法計(jì)算，低劑量組：1.04 g/mL，中劑量組：2.08 g/mL，高劑量組：4.16 g/mL，分別相當(dāng)于臨床等效劑量的1、2、4倍。制備后于4 ℃冰箱中貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3動(dòng)物分組 接種24 h后小鼠稱質(zhì)量編號(hào)，隨機(jī)分為5組：參芪化淤方高、中、低劑量組，CTX對照組，模型組，每組10只。另10只未接種者作為陰性對照組。

1.2.4給藥 參芪化淤方高、中、低劑量組分別予以0.4 mL參芪化淤方灌胃，CTX對照組予以0.2 mL CTX溶液(小鼠給藥劑量為20 mg·kg-1·d-1)腹腔注射，模型組予以0.4 mL生理鹽水灌胃，均每日1次，給藥14 d。實(shí)驗(yàn)過程中，由于灌胃操作不當(dāng)，造成中劑量組小鼠死亡1只，低劑量組小鼠死亡2只。

1.2.5樣品采集 于實(shí)驗(yàn)第15天(末次給藥后24 h)，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后將小鼠稱質(zhì)量，然后頸椎脫臼法處死，剖腹，剝離肝臟、脾臟及胸腺。取各組小鼠肝臟瘤塊及正常肝組織3 mm×3 mm，每例標(biāo)本4～5塊，生理鹽水充分洗滌；同時(shí)將脾臟及胸腺稱質(zhì)量。

1.2.6觀測指標(biāo) (1)小鼠生活狀態(tài)觀察：實(shí)驗(yàn)前將小鼠稱質(zhì)量，并在實(shí)驗(yàn)過程中觀察小鼠的飲食、毛發(fā)色澤、活動(dòng)度、糞便等。(2)對小鼠肝癌免疫器官的影響：將脾臟、胸腺剝離后稱質(zhì)量，記錄并計(jì)算脾指數(shù)及胸腺指數(shù)：胸腺指數(shù)=胸腺質(zhì)量(mg)/體質(zhì)量(g)；脾指數(shù)=脾質(zhì)量(mg)/體質(zhì)量(g)。(3)腫瘤抑制率測定：將肝臟中的瘤塊剝離，稱質(zhì)量，計(jì)算各組小鼠平均瘤質(zhì)量及腫瘤生長抑制率。腫瘤抑制率=(模型組平均瘤質(zhì)量-治療組平均瘤質(zhì)量)/模型組平均瘤質(zhì)量×100%。(4)對腫瘤組織survivin基因表達(dá)的影響：采用免疫組化法檢測，嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。每次實(shí)驗(yàn)均設(shè)計(jì)空白對照組做陰性對照。光學(xué)觀察，在(×400)鏡下選取每張切片中survivin 著色最明顯的視野，采集圖像，并利用Image-proplus圖像分析軟件檢測染色陽性物質(zhì)的面積(占總面積的百分比)及積分吸光度(IA)，求IA平均值，用平均IA值代表組織中survivin表達(dá)水平的高低。

2 結(jié) 果

2.1參芪化淤方對H22肝癌荷瘤小鼠生活狀態(tài)的影響 在實(shí)驗(yàn)前，各組小鼠精神狀態(tài)良好、活潑好動(dòng)、飲食正常、皮毛潔白光澤、皮膚黏膜紅潤、眼角干凈、球形糞便且干稀適中。造模后，初期各組小鼠的生活狀態(tài)與造模前基本相同，但是隨著造模時(shí)間的延長(大約5～7 d后)，小鼠右前肢腋窩下出現(xiàn)包塊并逐漸增大，同時(shí)伴隨納食減少、活動(dòng)減少、體質(zhì)量下降、皮毛松散凌亂且干枯不澤、大便黃爛等癥。其中CTX對照組和參芪化淤方低劑量組癥狀較模型組輕；而中、高劑量組小鼠癥狀較前兩組更輕。

2.2參芪化淤方對H22肝癌荷瘤小鼠免疫器官的影響 參芪化淤方高、中、低劑量組對小鼠的脾臟及胸腺具有一定保護(hù)作用。其中低劑量組與CTX對照組療效相當(dāng)，與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而中、高劑量組對脾臟及胸腺的保護(hù)作用更強(qiáng)(P<0.01)，量效關(guān)系成正比。見表1。

表1 各組小鼠脾指數(shù)及胸腺指數(shù)的比較±s)

2.3參芪化淤方對H22肝癌荷瘤小鼠的腫瘤抑制率 參芪化淤方中、高劑量組對H22型肝癌小鼠腫瘤抑制作用明顯(P<0.01)，低劑量組和CTX對照組也有一定的抑制作用，與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

2.4參芪化淤方對H22肝癌荷瘤小鼠survivin基因的影響 小鼠正常肝組織中(陰性對照組)不表達(dá)survivin基因；模型組小鼠肝組織中高表達(dá)survivin基因，與CTX對照組及參芪化淤方低劑量組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且參芪化淤方中、高劑量組的抑制作用更顯著(P<0.01)，見表3、封2圖1。

表2 各組小鼠的平均瘤質(zhì)量及腫瘤抑制率比較

表3 各組小鼠survivin基因表達(dá)水平比較

3 討 論

原發(fā)性肝癌是最常見的人類致死性癌癥之一[1]，其病死率仍居高不下。現(xiàn)臨床通常根據(jù)病情的發(fā)展將原發(fā)性肝癌分為早、中、晚期，針對不同時(shí)期采用不同的治療方法。隨著分子生物學(xué)和免疫學(xué)的發(fā)展，腫瘤的基因治療也越來越受到人們的重視。survivin是一種凋亡抑制基因，是迄今為止發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)的凋亡抑制因子，位于染色體17q25，其編碼的蛋白具有142個(gè)氨基酸。有研究發(fā)現(xiàn)，survivin只表達(dá)于腫瘤和胚胎組織中，在正常組織及癌旁組織中幾乎不表達(dá)[2-7]。在肝癌組織中，survivin高度表達(dá)，其表達(dá)的程度與腫瘤的嚴(yán)重程度密切相關(guān)，而且該基因的異常表達(dá)出現(xiàn)在腫瘤細(xì)胞的早期或更早，對肝癌的早期診斷亦具有重要意義。本研究亦顯示H22肝癌荷瘤瘤塊survivin基因表達(dá)增強(qiáng)，與已有的研究報(bào)道一致。

中醫(yī)藥通過扶正祛邪來達(dá)到提高患者免疫力及自身抑癌(抗癌能力)，對腫瘤具有較好的療效，特別在改善患者生存質(zhì)量方面，具有一定的優(yōu)勢[8-16]。參芪化淤方是本課題組在臨床上用于治療原發(fā)性肝癌的經(jīng)驗(yàn)方，臨床應(yīng)用對原發(fā)性肝癌具有較好的療效，可以顯著改善患者的臨床癥狀，提高患者的生存質(zhì)量。本研究實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)證明高、中、低劑量組的參芪化淤方在腫瘤抑制作用明顯的前提下，對H22肝癌小鼠survivin基因的異常表達(dá)均具有顯著的抑制作用(P<0.05)，且該抑制作用與用藥劑量成正比。該結(jié)果證實(shí)本方對肝癌的治療療效確切，而且其治療作用與抑制survivin基因的異常表達(dá)具有關(guān)聯(lián)性。同時(shí)證實(shí)肝癌的發(fā)生與survivin基因的異常表達(dá)有關(guān)。另外，本方在改善小鼠肝癌癥狀的同時(shí)對小鼠的免疫器官具有一定的保護(hù)作用，提示其能夠改善患者生存質(zhì)量。

參芪化淤方為復(fù)方制劑，成份復(fù)雜，而每種成份抑制腫瘤生長的機(jī)制可能是多方面的，由于本課題組水平及時(shí)間有限，只選用了一個(gè)代表性的指標(biāo)，因此具體作用機(jī)制和作用環(huán)節(jié)尚待深入研究。

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