嗜酸乳桿菌應用高質量分數脫脂乳的發酵工藝優化

粘靖祺，田芬，項麗麗，霍貴成

（1.東北農業大學乳品科學教育部重點實驗室，哈爾濱 150030；2.光明乳業股份公司，上海 200000）

嗜酸乳桿菌應用高質量分數脫脂乳的發酵工藝優化

粘靖祺1，田芬1，項麗麗2，霍貴成1

（1.東北農業大學乳品科學教育部重點實驗室，哈爾濱 150030；2.光明乳業股份公司，上海 200000）

將篩選出的嗜酸乳桿菌接種于25%的高質量分數脫脂乳中發酵,在單因素pH值、溫度以及接種量試驗的基礎上，采用響應面法優化發酵工藝，獲得高濃度的嗜酸乳桿菌活菌。結果表明：高質量分數25%脫脂乳培養基對菌株的生長有一定促進作用，得到高活菌數嗜酸乳桿菌的最佳發酵工藝為發酵pH值為5.81、發酵溫度37.30℃、接種量3.18%，活菌數可達2.78×109mL-1。

嗜酸乳桿菌；高質量分數脫脂乳；發酵條件；響應面法

0 引言

嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus)廣泛應用于發酵制品和膳食輔助材料中，是具有平衡人體胃腸道菌群、治療腹瀉、降低膽固醇和抑制有害菌等促健康作用的益生菌[1]，具有較高的開發價值[2]。脫脂乳是一種常用且易獲取的發酵培養基原料，可供給乳酸菌生長所需的充足營養[3]，另外固形物量較大，具有良好的酸堿緩沖作用[4]。本實驗通過對脫脂乳培養基濃度的調整、培養基營養因子的改良、發酵工藝參數的優化，使嗜酸乳桿菌達到高密度發酵。在工業化生產中，將含有高濃度脫脂乳的發酵液直接進行干燥處理，制備成活菌含量較高的益生菌粉，去除了其他培養基帶來的多種工業化后處理的困難，不但縮減了成本，并且降低了發酵液染菌的概率[5]，為大規模產業化生產益生菌菌粉提供了一條實用的工藝路線。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

菌株：嗜酸乳桿菌KLDS AD3-SU（東北農業大學乳品教育部重點實驗室菌種保藏中心提供）。

材料與設備：MRS優化培養基；脫脂乳；KLF2000 3.7L發酵罐；電熱恒溫培養箱DHP-9272；HCl (0.01mol/L),NaOH（0.01mol/L）.

1.2 實驗方法

1.2.1 嗜酸乳桿菌的傳代、活化和計數

將篩選出的性能較好的嗜酸乳桿菌KLDS AD3-SU用質量分數為12%脫脂乳活化，于37℃恒溫箱里培養24 h左右，活化3代；選擇不同濃度的脫脂乳來進行發酵，活菌計數采用稀釋傾注法。

1.2.2 單因素試驗

質量分數為25%脫脂乳培養基滅菌條件：110℃，10 min，分別從葡萄糖添加量，pH值，接種量，溫度4個單因素進行發酵實驗[6]。以活菌數為指標，分別于14 h（該菌株的穩定期前期時間）取菌液測活菌數。

葡萄糖添加量分別為1%，2%，3%，4%（均為質量分數）；發酵pH值分別設為5.8，6.0，6.2，6.4；發酵溫度分別設為30，34，37，40℃；接種量分別設為1%，2%，3%，4%。

1.2.3 響應面法優化嗜酸乳桿菌在高濃度發酵液的發酵條件

根據單因素實驗結果，選取發酵pH值(x1)、發酵溫度(x2)和接種量(x3)3個因素為自變量，以活菌數為響應值，進行中心組合試驗設計。每個實驗重復3次，取平均值，實驗因素水平及編碼如表1所示。

表1 實驗因素水平編碼表

1.2.4 模型的驗證

通過響應面法優化嗜酸乳桿菌發酵高質量分數脫脂乳，取得高密度活菌，得出最佳工藝條件，并用驗證實驗來驗證該模型的有效可行性。每個試驗重復3次，取其平均值。采用Design Expert 7.1軟件和Microsoft Excel 2003統計軟件進行單因素方差分析、差異顯著性分析和響應面分析[7]。

2 結果與分析

2.1 生長曲線的比較

圖1為嗜酸乳桿菌KLDS AD3-SU在不同濃度的脫脂乳培養基中的生長趨勢。由圖1可以看出，在4種不同質量分數的脫脂乳中，嗜酸乳桿菌KLDS AD3-SU的生長趨勢較為接近，進入穩定期的時間均為14 h，相比其他質量分數，在質量分數為25%脫脂乳中生長的嗜酸乳桿菌活菌數最高，可能原因為質量分數高的脫脂乳中固形物含量較高，故營養物質含量充足，可更好的滿足該菌株生長。相較于其他3種質量分數脫脂乳，質量分數為25%脫脂乳中的生長趨勢較為平緩。可能是由于較高質量分數的脫脂乳對產生的乳酸有一定的緩沖能力，降低了因發酵液環境中的局部酸度過高而抑制嗜酸乳桿菌生長的情況。將嗜酸乳桿菌接種于大于質量分數25%的脫脂乳中生長的趨勢及活菌數基本一致。因此，本研究選用質量分數為25%的脫脂乳作為培養基。工業發酵一般采用質量分數為10%～12%的脫脂乳發酵乳酸菌[4]，下游中再添加質量分數為12%的脫脂乳作為保護劑進行噴霧干燥。本實驗為避免分批分步添加脫脂乳的工藝繁瑣，多次添加輔料造成工藝染雜菌的情況，同時可降低成本，故一次性添加25%脫脂乳作為培養基，達到了更好的優化工業發酵條件的效果。

2.2 單因素實驗

根據乳酸菌利用糖代謝的方式，其優先利用葡萄糖作為碳源[8]，為使嗜酸乳桿菌的穩定期提前，嘗試在培養基中添加不同梯度的葡萄糖與未添加葡萄糖，比較嗜酸乳桿菌KLDS AD3-SU在不同培養基中生長趨勢的差異，結果如圖2所示。由圖2可以看出，得到在12 h時活菌數的明顯差異。另外，有文獻報道添加益生元對嗜酸乳桿菌的生長有促進作用[9-10]，但本研究添加果糖和菊粉后[11-12]，活菌提升變化不明顯，可能是本研究篩選的菌株更偏愛于吸收葡萄糖，另外高質量分數的脫脂乳培養基中提供給微生物生長所需的營養成分充足，因此不再另外添加營養因子。

如圖2所示，添加葡萄量為2%時，活菌數達到最大，所以在單因素試驗以及響應面優化中，都均向質量分數為25%脫脂乳中添加2%的葡萄糖作為培養基進行實驗，其進入穩定期時間從原來的14 h提前到12 h，單因素實驗的活菌數都是在14 h下測定的。

圖3為pH值對活菌數的影響。如圖3可以看出，pH值變化對高濃度培養基中嗜酸乳桿菌的活菌數影響明顯。為了降低pH值到5.6，加入的HCl過多導致酪蛋白沉淀，不利于菌種通過代謝蛋白進行繁殖，從而抑制了菌株生長，當發酵pH值為5.8時，活菌數達到最大，隨發酵pH值繼續增加，活菌數呈逐漸下降趨勢，嗜酸乳桿菌比較偏向于酸性環境，pH值的繼續升高對其生長不利[13]。

圖4為接種量對活菌數的影響。如圖4可以看出，隨時接種量的增加，活菌數呈上升趨勢，在接種量3%時嗜酸乳桿菌活菌數KLDS AD3-SU的活菌數最高，當接種量達到4%時，活菌數降低，可能是由于初期菌體產生的乳酸過多，反而抑制了活菌數的增加。因此接種量選擇3%為宜。

圖5為溫度對活菌數的影響。如圖5可以看出，發酵溫度[14]的對嗜酸乳桿菌的活菌數影響顯著。從30℃到37℃，隨著溫度上升，活菌數也相應提高，達到37℃時，活菌數最高，隨后活菌數隨發酵溫度的升高呈逐漸下降趨勢。說明37℃是該菌最適宜生長的溫度，該菌的耐熱性差，溫度過高反而抑制其生長。

2.3 響應面模型的建立及其顯著性

根據上面單因素試驗的結果,通過Design Expert7.1軟件對培養條件設計了3因素3水平試驗,所得數據分析結果如表2所示。

然后對上述回歸模型進行方差分析，結果如表3所示。結果表明：交互項pH值與溫度、pH值與接種量對活菌數的影響不顯著，各單因素及溫度和接種量交互作用對活菌數的影響均顯著（P＜0.05），失擬項不顯著，回歸模型的決定系數為0.9905，說明該模型能夠解釋99.05%的變化，該模型擬合程度良好，試驗誤差小，因此，可用此模型對嗜酸乳桿菌在高濃度脫脂乳中發酵的發酵條件進行分析和預測。

表2 響應面實驗設計方案及結果

表3 響應面回歸模型的方差分析

比較F值可知，3因素對嗜酸乳桿菌的活菌數影響大小依次為：接種量＞pH值＞發酵溫度。并且3個因素的影響均為極顯著（P＜0.01）。利用Design Expert軟件，對表2的數據進行回歸擬合分析，可得到響應值活菌數對數y對編碼自變量x1、x2和x3的回歸方程為

對表2數據進行二次多元回歸擬合，所得到的二次回歸方程的響應面分別如圖6～圖8所示。

由圖6可以看出，兩個因素的交互項不顯著，由響應面可以看出，接種量值不變，活菌數隨溫度和pH值的增加而迅速增加，當溫度為37～37.5℃時，活菌數最高。pH值在5.7～5.9范圍內，活菌數較高。

由圖7可以看出，兩個因素的交互項也不顯著，由響應面可以看出，溫度不變，活菌數隨pH的升高而逐漸增加，當pH值超過5.9時，活菌數降低。同樣的，由圖8可以看出，發酵溫度在30～37℃，接種量在2.5%～3.8%范圍內，活菌數較高。相關研究表明，在較低的pH值培養的乳酸菌菌存活率高，而在最適pH值的菌存活率低[15]，因此在生產嗜酸乳桿菌活菌制品時，可考慮在一定范圍內降低pH值，以延長存活期。

2.4 最優條件的確定

通過上述回歸模型，采用Design-Expert 7.1軟件優化發酵條件，獲得嗜酸乳桿菌KLDS AD3-SU在高質量分數脫脂乳中的最適發酵條件為：發酵pH值5.81，發酵溫度37.30℃，接種量3.18%，在此條件下活菌數（對數值）為9.44289 mL-1，即2.78×109mL-1。采用上述條件進行實際的驗證，經過3次重復實驗得到活菌數的平均值為3.12×109mL-1，試驗值與分析值的相對誤差為0.5%，較優化前提高的36.19%。證明采用響應面法優化得到的發酵條件準確可靠具有實用價值。

3 結論

通過數據分析及響應面法對嗜酸乳桿菌在高濃度的脫脂乳中發酵條件進行了優化，在質量分數為25%的脫脂乳培養家中添加質量分數為2%的葡萄糖，并得到嗜酸乳桿菌KLDS AD3-SU最優發酵條件。在以后的研究中應根據以上結論再對凍干條件和噴干進出口溫度的控制進行探索,以提高該菌的存活率。本實驗針對中小型企業提供了一種方便快捷的生產直投式發酵劑的方法，根據本課題研究思路可對其他乳酸菌的工業擴大生產，提供了便利的前提條件。

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Optimized the high mass fraction Fermentation Conditions for Lactobacillus acidophilus

NIAN Jing-qi1，TIAN Fen1，XIANG Li-li2,HUO Gui-cheng1
(1.Key Lab of Dairy Science,Ministry of Education,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China, 2.Bright Dairy&Food Co.,Ltd Shanghai 200000,China)

Using response surface methodology(RSM)for optimized the fermentation conditions for Lactobacillus acidophilus,high mass fraction of skimmed milk was used as the medium,based on the single factor tests of fermentation pH,fermentation temperature and inoculation amount.Results suggested that contain 25%of the high mass fraction of skimmed milk can partly promote the growth of Lactobacillus acidophilus,the optimal culture conditions:pH 5.8,inoculation amount of 3.18%and fermentation temperature of 37.30℃.the viables could reach 2.78×109cfu/ml.

Lactobacillus acidophilus;high mass fraction of skimmed milk;technical condition optimization;response surface method

TS252.1

A

1001-2230（2012）05-0034-04

2012-12-07

“乳酸菌代謝調控與發酵劑制造技術”教育部長江學者和創新團隊發展計劃資助（IRT0959）。

粘靖祺（1987-），女，碩士，研究方向為乳品科學與微生物。

霍貴成