酵母菌對(duì)發(fā)酵乳質(zhì)構(gòu)和蛋白的影響

李先勝，姜鐵民，陳歷俊,

(1.大連工業(yè)大學(xué)，遼寧大連 116034；2.北京三元食品股份有限公司，北京 100085)

酵母菌對(duì)發(fā)酵乳質(zhì)構(gòu)和蛋白的影響

李先勝1，姜鐵民2，陳歷俊1,2

(1.大連工業(yè)大學(xué)，遼寧大連 116034；2.北京三元食品股份有限公司，北京 100085)

探討了酵母菌對(duì)酸奶蛋白和質(zhì)構(gòu)的影響。添加酵母菌沒(méi)有對(duì)酸奶的質(zhì)構(gòu)造成顯著性的影響，添加酵母菌的樣品沒(méi)有產(chǎn)生更多種類(lèi)的多肽，但是氨基氮和游離氨基酸質(zhì)量濃度下降，這可能是酵母菌與乳酸菌之間存在對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)競(jìng)爭(zhēng)利用的原因。

質(zhì)構(gòu)；多肽；氨基氮；氨基酸

0 引言

在乳制品發(fā)酵過(guò)程中乳酸菌發(fā)酵占主導(dǎo)地位，但在亞洲、東歐、非州等傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品，如Kefir、Koumiss、Airag、Amasi、Cheeses產(chǎn)品中，酵母菌和乳酸菌起著同樣重要的作用，酵母能夠?yàn)楫a(chǎn)品帶來(lái)期望的香氣和風(fēng)味[1]。近年來(lái)，不斷發(fā)現(xiàn)酵母菌作為附屬發(fā)酵劑對(duì)乳制品發(fā)酵和成熟過(guò)程中的風(fēng)味影響、抑制有害菌的生長(zhǎng)及對(duì)人體的潛在益生功能等[2-4]。

酵母菌產(chǎn)生的二氧化碳會(huì)破壞凝乳，但二氧化碳能促進(jìn)乳酸菌的活性，同時(shí)也能有效抑制有害微生物的生長(zhǎng)，延長(zhǎng)有害微生物的生長(zhǎng)周期[5]。C.zeylanoides、K.marxianus、Yarrowia.lipolytica、Debaryomyces hansenii、Geotrichum candidum這些酵母菌對(duì)蛋白質(zhì)有很強(qiáng)的水解作用[6]。

本文選用傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品中常見(jiàn)的酵母菌Kluyveromyces marxianus和Saccharomyces cerevisiae，探討酵母菌對(duì)酸奶質(zhì)構(gòu)和蛋白的影響，為開(kāi)發(fā)新型發(fā)酵乳制品提供理論支持。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料

1.1.1 供試菌株

酵母菌：馬克思克魯維酵母和釀酒酵母，乳酸菌（丹尼斯克直投菌種YO-MIX611）：嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌。

1.1.2 材料與試劑

脫脂奶粉，Whatman定量濾紙NO.1，3 ku超濾離心管，乙腈，三氟乙酸，其他試劑均為分析純，鄰苯二甲醛試劑：準(zhǔn)確秤取40 mg的OPA溶解于1 mL甲醇中，加入100 μL β-巰基乙醇、0.95 g四硼酸鈉、0.5 g SDS，溶解后定容50 mL，現(xiàn)用現(xiàn)配，AccQ Tag Ultra化學(xué)包。

1.1.3 儀器

離心機(jī)，質(zhì)構(gòu)儀（TA.XT.Plus），C-18反相柱（Venusil ASB C18 4.6*250 mm/5 um），雙光束紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（Cintra20），高效液相色譜儀（LC10Avp），超高效液相色譜儀（ACQUITY），氨基酸分析色譜柱（AccQ·Tag Ultra色譜柱2.1 mm×100 mm，1.7 μm），pH計(jì)。

1.2 方法

1.2.1 酸奶的制作

將酵母菌和乳酸菌對(duì)數(shù)值分別以5.3 mL-1和6.3 mL-1的初始濃度接種到滅菌（110℃，10 min）的120 g/ L的脫脂奶中，于30℃下發(fā)酵，pH值降低至4.6時(shí)結(jié)束發(fā)酵，置于4℃冰箱中保存。

1.2.2質(zhì)構(gòu)儀程序設(shè)定

測(cè)定前下降速度為2 mm/s，測(cè)定速度為1 mm/s，測(cè)定距離為30 mm，測(cè)定后速度10 mm/s。采用A/BE探頭，直徑35 mm。測(cè)定前用1 kg砝碼進(jìn)行質(zhì)構(gòu)儀較正。

1.2.3 氨基氮質(zhì)量分?jǐn)?shù)通過(guò)OPA法測(cè)量

取一定量的凝乳，置于研缽中，研磨成細(xì)小顆粒后用手持均質(zhì)機(jī)均質(zhì)2 min。用濃度為1 mol/L鹽酸調(diào)pH值至4.6，室溫下靜置30 min，在3 000 g離心30 min。上清液（pH46可溶性部分）用Whatman定量濾紙（NO.1）過(guò)濾，濾液保存于-20℃待用。

取50 μL上清液加入1 mL鄰苯二甲醛試劑中，室溫下計(jì)時(shí)反應(yīng)2 min，340 nm處測(cè)定吸光度。氨基酸標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制作：配制質(zhì)量濃度為1 g/L的亮氨酸溶液，稀釋后質(zhì)量濃度分別為50，100，200，300，400和500 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液系列，按照上述方法測(cè)定吸光度，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，計(jì)算樣品中氨基氮的質(zhì)量濃度。

1.2.4 氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測(cè)定

將上清液pH值調(diào)至8.2～10之間，用3 ku的超濾離心管進(jìn)行超濾，再用AccQ Tag Ultra方法進(jìn)行氨基酸的柱前衍生，具體方法如下:(1)將樣品、AccQ·Tag Ultra硼酸鹽緩沖劑和中和試劑添加到完全回收樣品瓶中。(2)加入20 μLAccQ·Tag Ultra試劑，立即渦旋混合幾秒鐘,等待1 min。(3)將樣品瓶置于55°C下加熱10 min。液相檢測(cè)器、梯度洗脫程序和樣品管理器設(shè)置如表1-表3所示。流動(dòng)相A為洗脫液A1，流動(dòng)相B為洗脫液B。

表1 PDA檢測(cè)器參數(shù)

表2 UPLC梯度洗脫程序

1.2.5 反相色譜法檢測(cè)pH4.6可溶部分多肽的變化

取保存的pH值為4.6上清液，用0.22 μm的膜過(guò)濾后，用于液相分析。液相分析條件：采用C-18柱，柱溫為35℃。液相條件：溶劑A為體積分?jǐn)?shù)0.1%的TFA水溶液；溶劑B為體積分?jǐn)?shù)0.1%的TFA乙腈溶液，流速為0.8 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為214 nm。上樣量為10 μL。梯度洗脫程序如表4所示。

表3 樣品管理器參數(shù)

表4 RP-HPLC梯度洗脫程序

2 結(jié)果分析

2.1 質(zhì)構(gòu)的變化

酵母菌產(chǎn)生的二氧化碳會(huì)破壞凝乳，但傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品中乳清是要排出的，發(fā)酵過(guò)程從產(chǎn)生的氣體破壞凝乳，這有助于乳清的排出[7]。發(fā)酵初期酵母菌會(huì)通過(guò)有氧呼吸消耗掉脫脂奶中溶解的氧氣，使乳酸菌的產(chǎn)酸速度加快，從而增加凝乳的硬度[8]。表5為酸奶的質(zhì)構(gòu)。

由表5可以看出，不同酵母菌對(duì)酸奶的硬度、稠度、黏度和黏聚性均有一定的影響，添加馬克思克魯維酵母和釀酒酵母的樣品在硬度、稠度、黏度和黏聚性上均有所增加,但沒(méi)有發(fā)生顯著性的增加（P＜0.05）。說(shuō)明酵母菌的添加沒(méi)有對(duì)酸奶的質(zhì)構(gòu)產(chǎn)生顯著性的影響。

2.2 多肽的變化

C18色譜柱能使分子量小于5 000 u的多肽達(dá)到較好的分離效果，出峰時(shí)間越晚，多肽的相對(duì)疏水性越強(qiáng)。圖1為pH4.6-SN液相分析結(jié)果。

由圖1可以看出，pH值為4.6可溶性多肽是由多種不同極性的肽段組成，脫脂奶經(jīng)發(fā)酵后多肽的種類(lèi)增加。添加酵母菌樣品的色譜圖與未添加酵母菌樣品的色譜圖基本一致，說(shuō)明酵母菌的添加沒(méi)有增加多肽的種類(lèi)，酸奶在發(fā)酵過(guò)程中，起主要作用的是乳酸菌。

2.3 氨基氮質(zhì)量濃度的變化

氨基氮主要包括一些小肽和游離氨基酸，它們對(duì)酸奶風(fēng)味產(chǎn)生重要作用。質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12%的TCA可溶性肽是小于7肽的小肽。發(fā)酵劑的蛋白酶和肽酶對(duì)12% TCA可溶性氮貢獻(xiàn)較大。采用鄰苯二甲醛分光光度法測(cè)定12%TCA可溶性組分中氨基氮的質(zhì)量濃度結(jié)果如表6所示。

表5 酸奶的質(zhì)構(gòu)

表6 氨基氮質(zhì)量濃度

由表6可以看出，酵母菌和乳酸菌對(duì)脫脂奶進(jìn)行發(fā)酵后的樣品，與未添加酵母菌的樣品相比氨基氮質(zhì)量濃度有了一定程度的下降，其中添加釀酒酵母菌樣品的氨基氮含量顯著下降（P＜0.05）。這可能是酵母菌和乳酸菌之間存在營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)競(jìng)爭(zhēng)利用的原因。

2.4 游離氨基酸質(zhì)量濃度的變化

游離氨基酸是影響發(fā)酵乳制品風(fēng)味的重要組成成分，其中許多小肽的風(fēng)味是由其末端的氨基酸決定的；由于高質(zhì)量濃度的游離氨基酸對(duì)感官有促進(jìn)作用，總游離氨基酸質(zhì)量濃度與良好風(fēng)味的提高密切相關(guān)[9]；其中芳香族氨基酸、支鏈脂肪酸和甲硫氨酸是風(fēng)味化合物的主要前體物質(zhì)，特別是甲硫氨酸能提供一種良好的黃油味和奶香味[10]。陳歷水研究表明，酵母菌單獨(dú)發(fā)酵后牛乳的游離氨基酸質(zhì)量濃度有所增加，酵母菌能分泌一定量的蛋白酶、肽酶或者氨基轉(zhuǎn)移酶，通過(guò)這些酶對(duì)牛乳中的蛋白質(zhì)進(jìn)行水解得到了更多的游離氨基酸[11]。

酵母菌和乳酸菌對(duì)脫脂奶進(jìn)行發(fā)酵后的樣品，與未添加酵母菌的樣品相比總的游離氨基酸含量有了一定程度的下降，分別從272.36 mg/L下降到218.67 mg/L（馬克思克魯維酵母）和150.84 mg/L（釀酒酵母）。單個(gè)游離氨基酸含量也發(fā)生了變化，如蛋氨酸從2.28下降到1.74 mg/L（馬克思克魯維酵母）和0.62 mg/L（釀酒酵母）；脯氨酸從67.75 mg/L下降到55.33 mg/L（馬克思克魯維酵母）和54.99 mg/L（釀酒酵母）；異亮氨酸從5.11 mg/L下降到3.44 mg/L（馬克思克魯維酵母）和2.08 mg/L（釀酒酵母）。添加酵母菌后氨基酸的質(zhì)量濃度有所下降，這可能是酵母菌與乳酸菌之間存在對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)競(jìng)爭(zhēng)利用的原因。

3 結(jié)論

酵母菌沒(méi)有對(duì)酸奶的硬度、稠度、黏度和黏聚性產(chǎn)生顯著性的影響，添加酵母菌樣品與未添加酵母菌樣品的pH4.6上清液相比，沒(méi)有產(chǎn)生更多種類(lèi)的多肽，添加酵母菌的樣品的氨基氮含量有所下降，其中添加釀酒酵母樣品的氨基氮質(zhì)量濃度顯著下降（P＜0.05），添加酵母菌樣品的氨基酸質(zhì)量濃度有所下降，這可能是酵母菌與乳酸菌之間存在對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)競(jìng)爭(zhēng)利用的原因。

表7 發(fā)酵酸乳游離氨基酸質(zhì)量濃度mg/L

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Influence of yeasts on protein and texture of fermented milk

LI Xian-sheng1，JIANG Tie-min2，CHEN Li-jun1,2
（1.Dalian Polytechnic University,Dalian 116034，China;2.Beijing Sanyuan Foods CO.Ltd.,Beijing 100085，China）

The influence of yeasts on yogurt protein and texture were investigated.The effect of yeasts on texture of yogurt was not significant. The samples added yeasts did not produce more peptide.The content of amino nitrogen and free amino acid were decreased.The reason may be that yeasts and LAB exist nutrient competition.

texture；polypeptide；amino nitrogen；amino acid

TS252.1

A

1001-2230（2012）05-0030-04

2012-02-14

國(guó)家科技部“十一五”支撐計(jì)劃（2009BADB9B06），國(guó)家“863”計(jì)劃(2011AA100903)，北京市科技計(jì)劃(D10110504600000)。

李先勝（1984-），男，碩士研究生，從事食品微生物方面的研究。

陳歷俊