高黏附力雙歧桿菌的篩選與鑒定

萬(wàn)翠香，章昭琳，王報(bào)貴，魏華，甘艷云

（1.南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南昌 330047；2.南昌大學(xué)中德聯(lián)合研究院，南昌 330047；3.江西省新余市農(nóng)業(yè)局，江西新余 338000）

高黏附力雙歧桿菌的篩選與鑒定

萬(wàn)翠香1,2，章昭琳1，王報(bào)貴1，魏華1,2，甘艷云3

（1.南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南昌 330047；2.南昌大學(xué)中德聯(lián)合研究院，南昌 330047；3.江西省新余市農(nóng)業(yè)局，江西新余 338000）

利用體外細(xì)胞培養(yǎng)法，從實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有的10株雙歧桿菌中篩選具有較強(qiáng)粘附能力的菌株。采用革蘭氏染色法和平板計(jì)數(shù)法，評(píng)價(jià)了這10株雙歧桿菌對(duì)HT-29細(xì)胞的粘附性能，通過(guò)測(cè)定這10株雙歧桿菌的16S rRNA基因序列（16S rDNA）進(jìn)行分類(lèi)學(xué)鑒定。結(jié)果顯示，WBBI01，WBBI02，WBIN03，WBBI06具有極強(qiáng)的黏附力，其黏附指數(shù)分別達(dá)1.97×103，2.17×103，3.57×103，1.88×103。經(jīng)16S rDNA測(cè)序鑒定WBBI01，WBIN03，WBBI06均與兩歧雙歧桿菌S17有極高的同源性，而WBBI02屬于長(zhǎng)雙歧桿菌。結(jié)果表明，雙歧桿菌黏附性能具有明顯的種屬特異性，不同種屬雙歧桿菌的粘附能力相差極大，以?xún)善珉p歧桿菌的黏附性能最強(qiáng)，嬰兒長(zhǎng)雙歧桿菌為最弱。

益生菌；16S rDNA；黏附；雙歧桿菌；黏附指數(shù)

0 引言

雙歧桿菌是動(dòng)物腸道內(nèi)最重要的生理性細(xì)菌之一，能與腸道上皮細(xì)胞緊密聯(lián)系形成生物學(xué)屏障[1，2]，而黏附是其與宿主相互作用的第一步[3]，外源雙歧桿菌能否在腸道內(nèi)黏附和定殖是評(píng)定益生菌制劑效果的指標(biāo)之一。因此對(duì)雙歧桿菌黏附性能的研究具有重要的實(shí)際意義。

本研究采用體外細(xì)胞培養(yǎng)法[4]，以實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有的10株雙歧桿菌為對(duì)象，通過(guò)革蘭氏染色法和平板計(jì)數(shù)法評(píng)價(jià)各雙歧桿菌的黏附性能，篩選具有較強(qiáng)黏附力的菌株；采用分子生物學(xué)手段對(duì)各雙歧桿菌進(jìn)行了鑒定，并結(jié)合DNAMAN軟件分析了各菌株之間親緣關(guān)系。本研究為雙歧桿菌的黏附機(jī)制及保護(hù)作用研究提供了良好的模式材料和方法，篩選獲得的高黏附性能的雙歧桿菌菌株為開(kāi)發(fā)益生菌制劑提供材料。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料

菌株和細(xì)胞：10株雙歧桿菌均由本實(shí)驗(yàn)室保藏；人結(jié)腸癌細(xì)胞系HT-29細(xì)胞株由南昌大學(xué)一附院饋贈(zèng)。

培養(yǎng)基：MRS（Solarbio）；DMEM培養(yǎng)液（Hyclone）；胰蛋白酶-EDTA消化液（Solarbio）；胎牛血清（GIBCO），pH 7.4 PBS緩沖液，Taq PCR mix（Takara），T-載體（Takara）。

主要儀器：二氧化碳培養(yǎng)箱（Thermo），低速離心機(jī)（湘儀離心機(jī)），倒置光學(xué)顯微鏡，厭氧培養(yǎng)箱，血球計(jì)數(shù)板等。

1.2 方法

1.2.1 雙歧桿菌的細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn)[5]

HT-29細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)之前將細(xì)胞接至6孔細(xì)胞板培養(yǎng)14 h，每孔中加入1 mL益生菌的菌懸液(細(xì)菌數(shù)為1×108～2×108mL-1)和1 mL新鮮的DMEM[6]（pH=4.5）培養(yǎng)液，于37℃質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的CO2，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為95%空氣的二氧化碳培養(yǎng)箱中共孵育3 h。孵育結(jié)束后，輕柔吸走上清，預(yù)冷PBS漂洗細(xì)胞4次，以除去未黏附的細(xì)菌，甲醛固定，革蘭氏染色，鏡檢初步評(píng)價(jià)黏附能力。

1.2.2 雙歧桿菌的細(xì)胞黏附能力測(cè)定

將黏附結(jié)束的細(xì)胞培養(yǎng)板用2 mL冷PBS輕柔洗滌4次，之后加入400 L胰蛋白酶消化液消化1 min，加入600 L預(yù)冷的PBS終止反應(yīng)并輕輕吹打，將細(xì)胞及黏附的細(xì)菌制成菌懸液，吸到試管中，在振蕩器上充分振蕩，使細(xì)菌能夠分散懸浮[7,8]。然后將菌懸液進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)♂尩?05，然后從各個(gè)稀釋度取10 L分區(qū)點(diǎn)滴到MRS平板培養(yǎng)基上，吹干后倒置于厭氧培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)24 h后，進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，每株設(shè)立兩個(gè)平行樣本，每樣本設(shè)立3個(gè)重復(fù)。對(duì)照組細(xì)胞培養(yǎng)皿的細(xì)胞懸液用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板對(duì)細(xì)胞個(gè)數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)。根據(jù)活菌計(jì)數(shù)的結(jié)果以及對(duì)照培養(yǎng)皿細(xì)胞計(jì)數(shù)的結(jié)果，計(jì)算雙歧桿菌對(duì)HT-29[9]細(xì)胞的黏附效果。黏附指數(shù)以100個(gè)細(xì)胞上黏附的細(xì)菌數(shù)表示。

1.2.3 高黏附力雙歧桿菌的鑒定

利用16S rDNA分子生物學(xué)特征鑒定[10]。根據(jù)V3區(qū)兩端保守區(qū)設(shè)計(jì)引物，則能夠擴(kuò)增細(xì)菌V3區(qū)相對(duì)應(yīng)的可變區(qū)片段，測(cè)序分析比較來(lái)初步確定菌種的位置。設(shè)計(jì)引物為F:5’-GGTGAGAGTGGCGAACGGGT-3’，R:5’-AACGAGCGCAACCCTCGC-3’。以待測(cè)菌基因組為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)條件：95℃10 min，然后于94℃10 min，67℃30 s，72℃1.5 min擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)，72℃10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收后克隆到T載體上進(jìn)行測(cè)序。序列的同源性在GeneBank數(shù)據(jù)庫(kù)中使用BLAST工具進(jìn)行比較，并確定待測(cè)菌的分類(lèi)地位。

2 結(jié)果

2.1 革蘭氏染色法檢測(cè)10株雙歧桿菌的黏附能力

通過(guò)放大80倍的顯微鏡觀察了10株雙歧桿菌對(duì)HT-29細(xì)胞的黏附能力，結(jié)果如圖1所示。由圖1可以看出，雙歧桿菌屬的各種間不同菌株在體外對(duì)HT-29細(xì)胞的黏附能力相差很大，其中WBBI01, WBBI02,WBIN03,WBBR05,WBBI06,WLABO9雙歧桿菌均有較強(qiáng)的黏附力，WBBR04與WBLO01的黏附力較弱，而WBAN07雙歧桿菌黏附力極弱或幾乎沒(méi)有。

2.2 平板計(jì)數(shù)法評(píng)價(jià)10株雙歧桿菌的黏附能力

結(jié)果顯示：10株雙歧桿菌對(duì)HT-29細(xì)胞的黏附指數(shù)(菌體數(shù)目/100 HT-29 cell)分別為1.97×103，2.17× 103，3.57×103，2.82×102，1.71×103，1.88×103，5.00× 10，5.71×102，9.14×102，3.06×102，如圖2所示。

2.3 雙歧桿菌的16SrDNA鑒定

提取菌株的總DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到約1.4 kb的DNA片段。克隆測(cè)序后，將測(cè)定結(jié)果用Blastn進(jìn)行序列同源性比對(duì)，根據(jù)比對(duì)結(jié)果分析10株菌株，采用16S rDNA序列分析的方法鑒定到屬，具體結(jié)果如表1所示。

表1 16S rDNA鑒定結(jié)果

2.4 10株雙歧桿菌的同源性分析

本研究選取了4個(gè)系統(tǒng)發(fā)生組的雙歧桿菌典型株/標(biāo)準(zhǔn)株，另外以位于高GC含量的革蘭氏陽(yáng)性菌Listeria monocytogenesM7作為外群，基于Clustal V計(jì)算方法構(gòu)建了以16S rDNA序列為基礎(chǔ)的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)狀圖（見(jiàn)圖3）。

圖3中，顯示了所測(cè)序的10株雙歧桿菌與其它同屬標(biāo)準(zhǔn)株以及其它細(xì)菌的親緣關(guān)系。樹(shù)狀圖通過(guò)DNAMAN軟件中的Align程序基于Clustal V方法構(gòu)建，并以Listeria monocytogenesM7作為外群。樹(shù)狀圖上方標(biāo)尺bar（0.05）為千個(gè)核苷酸的替換率。

3 討論

雙歧桿菌在腸道中的黏附及定植，對(duì)維持腸道菌群的結(jié)構(gòu)及功能起主導(dǎo)作用，因此，研究雙歧桿菌的黏附機(jī)制對(duì)認(rèn)識(shí)微生態(tài)學(xué)的基本規(guī)律有著重要意義。粘附性能檢測(cè)是益生菌篩選的重要指標(biāo)之一[11-12]，目前國(guó)內(nèi)外學(xué)者普遍采用體外培養(yǎng)腸上皮細(xì)胞的方法來(lái)評(píng)價(jià)菌株的黏附能力[13]。

1985年Huub等人開(kāi)啟了雙歧桿菌黏附作用研究的先河，但其研究?jī)H針對(duì)兩歧雙歧桿菌的脂磷壁酸(LTA)，因此具有一定的局限性。20世紀(jì)90年代，Elo等人[14]采用體外細(xì)胞培養(yǎng)方法研究了4株雙歧桿菌對(duì)人腸癌細(xì)胞(Caco-2)的粘附能力，其研究發(fā)現(xiàn)：兩歧雙歧桿菌12-1和SBT 2752，長(zhǎng)雙歧桿菌SBT-2919和SBT2934均對(duì)Caco-2細(xì)胞幾乎沒(méi)有粘附或粘附力非常弱。2005年Candela等人[15]同樣采用體外細(xì)胞培養(yǎng)方法對(duì)比了7株雙歧桿菌菌株對(duì)人腸道上皮細(xì)胞(Caco-2)的黏附能力，其研究表明雙歧桿菌對(duì)Caco-2的黏附具有種屬特異性，其中兩歧雙歧桿菌S17的黏附值(菌體數(shù)目/100 Caco-2cell)高達(dá)5.85×103，而長(zhǎng)雙歧桿菌E18和動(dòng)物雙歧桿菌BBSF的黏附力較弱，其黏附值(菌體數(shù)目/100 Caco-2cell)分別為1.94×102,1.77×102。Crociani等人[16]將體外細(xì)胞培養(yǎng)方法與體內(nèi)試驗(yàn)進(jìn)行了比較，驗(yàn)證了雙歧桿菌體外黏附實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性，為以后體外細(xì)胞培養(yǎng)方法研究雙歧桿菌黏附作用提供了理論依據(jù)。

16S rDNA是編碼原核生物核糖體小亞基rRNA（16S rRNA）的基因，長(zhǎng)度約為1 500 bp，在結(jié)構(gòu)與功能上具有高度的保守性，是細(xì)菌分類(lèi)學(xué)研究中最常用、最有用的“分子鐘”，若16S rRNA基因相似性大于97%，可以斷定其為同一個(gè)屬，并且初步認(rèn)為其為同一個(gè)菌種(Gerald,2005)[17]。經(jīng)典的菌株分類(lèi)鑒定方法的最大缺陷在于即使進(jìn)行了完整的各種鑒定試驗(yàn)，也可能導(dǎo)致對(duì)所分離的菌株鑒定結(jié)果的不確定性。與之相比，16S rDNA全序列分析鑒定法具有簡(jiǎn)便、快速、靈敏和經(jīng)濟(jì)的優(yōu)點(diǎn)，是目前應(yīng)用最廣的分子微生物學(xué)檢測(cè)的靶基因，已被眾多學(xué)者用來(lái)對(duì)細(xì)菌的快速鑒定[18]。2004年涂宏鋼等人利用16S rRNA全長(zhǎng)序列鑒定了植物乳桿菌；2005年付曉艷等人通過(guò)16S rDNA測(cè)序?qū)⒔Y(jié)果與同屬及非同屬的乳酸菌進(jìn)行同源性比較，鑒定了乳酸乳球菌；2009年張朝正等人[10]利用16S rDNA序列分析和Biolog快速鑒定方法鑒定產(chǎn)脂肪酶菌株；2011年詹鑾峰等人[19]將16S rDNA檢測(cè)法應(yīng)用到臨床細(xì)菌的檢驗(yàn)中，其研究通過(guò)設(shè)計(jì)合成所有細(xì)菌的通用引物，實(shí)現(xiàn)了一個(gè)樣品中同時(shí)檢測(cè)多種細(xì)菌。本研究所用的雙歧桿菌對(duì)照株序列同測(cè)定序列的16S rRNA基因進(jìn)化分析表明，其在16S rDNA序列相似性基礎(chǔ)上聚類(lèi)為3個(gè)簇群：Bifidobacterium bifidum;Bifidobacterium animalis;Bifidobacterium longum.本研究中的16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果可以顯示出這種進(jìn)化模式，可以看出所分析的10株細(xì)菌起源于同一祖先。

本研究結(jié)合了各雙歧桿菌黏附實(shí)驗(yàn)的優(yōu)化方案，采用體外細(xì)胞培養(yǎng)法，以實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有的10株雙歧桿菌為對(duì)象，篩選具有較強(qiáng)黏附能力的菌株。黏附結(jié)果表明，雙歧桿菌各種屬間不同菌株在體外對(duì)HT-29細(xì)胞的黏附能力相差很大，其中WBBI01,WBBI02,WBIN03, WBBR05,WBBI06,WLABO9雙歧桿菌均有較強(qiáng)的黏附力，WBIN03具有最高的黏附值(菌體數(shù)目/100 HT-29 cell)：3.57×103。本研究篩選獲得的高黏附性能的雙歧桿菌菌株為開(kāi)發(fā)益生菌制劑提供了材料[20]。

[1]尤萍,馬玉龍.雙歧桿菌對(duì)腸上皮細(xì)胞粘附作用的研究機(jī)應(yīng)用展望.飼料工業(yè)，2004,25:42-6.

[2]劉國(guó)榮，潘偉好，暢曉淵等.雙歧桿菌的粘附特性及其對(duì)腸道致病菌的體外拮抗作用.微生物學(xué)通報(bào)，2009,36:716-21.

[3]孟祥晨，霍責(zé)成，張建友等.雙歧桿菌對(duì)腸上皮細(xì)胞粘附作用研究狀況.中國(guó)乳品工業(yè).2002,30:0003-04.

[4]魏銀萍，王斌，魏泓.益生菌株對(duì)HT-29細(xì)胞的粘附及對(duì)致病菌的粘附抑制性能研究.藥物研究,2006,15(8):0007-02.

[5]張毅強(qiáng),師帥帥.人大腸癌細(xì)胞原代培養(yǎng)方法的改進(jìn).吉林醫(yī)學(xué)，2010,31:442-4.

[6]林雪彥，牛鐘相.動(dòng)物消化道乳酸菌粘附機(jī)制及影響因素研究進(jìn)展.家畜生態(tài)學(xué)報(bào),2006,27:0109-04.

[7]LIU C,ZHANG Z Y,DONG K,et al.Adhesion and Immunomodulatory Effects of Bifidobacterium lactis HN019 on Intestinal Epithelial Cells INT-407[J].World J Gastroenterol,2010,16:2283-2290.

[8]CANDELA M,PERNA F,CARNEVALI P,et al.Interaction of Probiotic Lactobacillus and Bifidobacterium Strains with Human Intestinal EpithelialCells:AdhesionProperties,CompetitionagainstEnteropathogens and Modulation of IL-8 Production[J].International Journal of Food Microbiology,2008,125:286-292.

[9]劉長(zhǎng)寶陳愛(ài)華,凌志強(qiáng).HT-29腸癌細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附特性及作用機(jī)制研究.溫州醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2007,37:0429-04.

[10]張朝正，郭蘭珍.利用16S rDNA序列分析和Biolog快速鑒定方法鑒定產(chǎn)脂肪酶菌株.河北工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2009,38(5):0052-04.

[11]PREISING J,MARITA G,HUA W,et al.Selection of Bifidobacteria Based on Adhesion and Anti-Inflammatory Capacity In Vitro for Amelioration of Murine Colitis[J].Applied and Enviromental Microbiology,2010,76:3048–3051.

[12]周佳青,周梁,金曉杰.細(xì)胞因子IFN-γ和IL-1β對(duì)人喉鱗癌細(xì)胞粘附和浸潤(rùn)能力的影響.中國(guó)耳鼻咽喉顱底外科雜志,2005,11(4): 0217-04.

[13]RIEDEL C U,FRANCIS F,DARLENE R G,et al.Interaction of Bifidobacteria with Caco-2 Cells adhesion and Impact on Expression Profiles[J].International Journal of Food Microbiology,2006,110:62-68.

[14]ELO S M.Attachment of Lactobacillus Casei Strain GG to Human Colon Carcinoma Cell Line Caco-2：Comparison with Other Dairy Strains[J].Letters in Applied Microbiology,1991,13:154-156.

[15]CANDELA M,SEIBOLD G,VITALI B,et al.Real-time PCR Quantification of Bacterial Adhesion to Caco-2cells:Competition between Bifidobacteria and Enteropathogens[J].Res Microbiol, 2005,156(8):887-895.

[16]CROCIANI J.Adhesion of Different Bifidobacteria Strains to Human Enterocyte-Like Caco-2 Cells and Comparison with in Vivo Syudy [J].Letters in Applied Microbiology 1995;21:146-148.

[17]GERALD W T.Probiotics and Prebiotics-Scientific Aspects[J],Caister Academic Press，2005,12-38.

[18]王宏梅,于潔,包秋華，等.利用16S rDNA序列及tuf-RFLP鑒定蒙古國(guó)發(fā)酵乳中的乳酸菌.中國(guó)乳品工業(yè),2011,39(7):4-5.

[19]詹鑾峰,高鵬.16SrDNA檢測(cè)在臨床細(xì)菌檢驗(yàn)中的應(yīng)用,2011,07: 1140-1143.

[20]陳曦.乳桿菌屬的益生菌保健功能及研究進(jìn)展.中國(guó)乳品工業(yè), 2011,39(7):0040-04.

Screening and Identification of high adhesion Bifidobacteria to HT-29 Cell

WAN Cui-xiang1,2,ZHANG Zhao-lin1,WANG Bao-gui1,WEI Hua1,2,GAN Yan-yun3
(1.State Key Laboratory of Food Science and Technology,Nanchang University,Nanchang 330047,China；2.Jiangxi-OAI Joint Research Institute,Nanchang 330047,China；3.Jiangxi Xinyu Agricultural Bureau，Xinyu,338000,China)

The adhesion capacity of tenBifidobacteria strainsin vitro was investigated.Gram staining and plate counting method were used to evaluate their adhesion capacity to HT-29 cell,and 16S rDNA sequencing analysis was carried out to identify the strain..Based on the data in vitro,High attachment was observed inBifidobacteriaWBBI01,WBBI02,WBIN03,WBBI06,their adhesion index reached(bacterial cells/100 Caco-2 cells)1.97×103，2.17×103，3.57×103，1.88×103repectively,while low attachment was shown in other strains.Identification of the strain indicates that the homology ofBifidobacteriaWBBI01,WBIN03,WBBI06 with B.bifidumS17 were all above 99%,WBBI02 belongs toB.longum.The adhesion capacity varied considerably among different strains.B.bifidumWBIN03 was the most adhesive and the adhesion ability ofBifidobacteriaWBAN07 was the weakest among all the tested strains.

Bifidobacteria;16S rDNA sequencing;Identification;Adhesive activity

Q93-33

A

1001-2230（2012）05-0013-03

2011-12-26

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（30900038），國(guó)家“863”計(jì)劃專(zhuān)題（2008AA10Z337），國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31000048），2009年江西省主要學(xué)科學(xué)術(shù)和技術(shù)帶頭人培養(yǎng)計(jì)劃，江西省教育廳科研基金（GJJ10379）。

萬(wàn)翠香（1977-），女，副教授，主要從事益生菌的分子生物學(xué)研究。

章昭琳

book=33,ebook=163