蘇鐵珊瑚根結構觀察及其內生放線菌分離

曹 妍 ，伍建榕

蘇鐵珊瑚根結構觀察及其內生放線菌分離

曹 妍1，伍建榕2

(1.西南林業(yè)大學 林學院 云南省高校森林災害預警控制重點實驗室，云南 昆明 650224；2.國家林業(yè)局 西南地區(qū)生物多樣性保育重點實驗室，云南 昆明 650224）

蘇鐵類是現(xiàn)存最原始的裸子植物類群，被認為是活化石。為了探究清蘇鐵珊瑚根的結構和內生放線菌的多樣性，本研究采用石蠟切片法對蘇鐵珊瑚根進行顯微結構觀察，用改良的TWYE（M1）、高氏1號 (M2)和甘油—天冬酰胺（M3）培養(yǎng)基對珊瑚根的內生放線菌進行分離，并通過16S rRNA系列分析鑒定其種屬。結果表明：蘇鐵珊瑚根由周皮、外部皮層、藻胞層、內部皮層和維管柱組成；外部皮層和內部皮層細胞在橫切面上呈圓形，而且在有的細胞中能看到被染成暗紅色的菌絲團的存在；利用以上三種培養(yǎng)基從蘇鐵珊瑚根中共分離到了13株放線菌，隸屬于鏈霉菌屬和擬諾卡氏菌屬。

蘇鐵；珊瑚根；內生放線菌；分離;16S rRNA

蘇鐵Cycas revoluta又名鐵樹，為蘇鐵科Cycadaceae蘇鐵屬Cycas植物。蘇鐵被譽為植物界的“大熊貓”和“活化石”，為我國一級保護植物[1]。蘇鐵類植物全世界僅有蘇鐵目，現(xiàn)存有3個科，即蘇鐵科Cycadaceae、蕨鐵科Stangeriaceae和澤米鐵科Zamiaceae，11屬，約280多種[2]。我國蘇鐵僅有1科1屬，自然分布的蘇鐵屬植物約38種，約占世界蘇鐵屬植物總數(shù)的30%左右[3]。

蘇鐵除具有正常根和肉質根以外還發(fā)現(xiàn)有珊瑚狀根。珊瑚根是蘇鐵類植物的一類背地性生長的、重復二叉分枝的根叢，可暴露于土壤表面，形似珊瑚，因此得名[4]。蘇鐵珊瑚根結構與形成一直存在爭議，藍細菌的侵入是否必要成為爭議的熱點。而珊瑚根的形成是否與內生菌有關，這方面的研究尚未見報道。植物內生菌(endophyte)是一類生活史有部分或整個一生都在健康植物組織細胞內或細胞間生活，并且不會造成明顯的致病癥狀的微生物，包括細菌、放線菌、真菌[5]。由于內生放線菌生長緩慢，分離比較困難，相比內生真菌和細菌研究較少。近年來研究發(fā)現(xiàn)，內生放線菌宿主范圍廣，種類豐富，是放線菌資源的一個重要來源。蘇鐵為古老的孑遺植物，其研究重點一直是系統(tǒng)進化，而其內生菌的多樣性尚未見報道。

本研究旨在從蘇鐵珊瑚根結構觀察及內生放線菌的分離出發(fā)，探究清楚其結構和其中的微生物宿住情況及內生放線菌的多樣性，從而為促進蘇鐵快速繁育和生長提供基礎研究。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

實驗材料采自昆明市金殿森林保護區(qū)，該處土壤酥松，為紅壤土，蘇鐵珊瑚根生長旺盛，大多在地表下2～5cm處或裸露于地表。2011年4月在此處采集珊瑚根，放于冰盒中帶回實驗室，用自來水將泥土沖洗干凈，備用。

1.2 試驗方法

1.2.1 蘇鐵珊瑚根顯微結構觀察——石蠟切片法

將珊瑚根切成約0.5 cm的小段，用FAA固定液固定24小時以上。固定好的材料經叔丁醇從低濃度到高濃度系列脫水，石蠟包埋，旋轉切片機連續(xù)切片，厚度8 μm。切片干燥后用番紅固綠對染，再用中性膠封片，光學顯微鏡觀察并照相。材料經番紅固綠染色后，木質、角質、細胞核等為紅色，薄壁細胞為綠色。

1.2.2 蘇鐵珊瑚根內生放線菌的分離

(1) 材料的消毒 將材料在流水下沖洗干凈后，用刀片將二叉狀根切開，在無菌操作臺中先用75%的酒精對其處理30～60 s，無菌水清洗3次；0.1%的升汞消毒5 min，無菌水清洗3次。

(2) 放線菌的分離 將材料放進1.5 mL的滅菌離心管中，加入0.5 mL的無菌水，用杵棒將其搗碎，靜置10 min后吸取0.2 mL菌懸液分別涂布在改良的TWYE（M1）、高氏1號培養(yǎng)基(M2)、甘油—天冬酰胺培養(yǎng)基（M3）上，即分別在3種培養(yǎng)基中添加100 mg/L的重鉻酸鉀，28 ℃恒溫培養(yǎng)。約3周后，根據(jù)平板上長出菌落的形態(tài)、顏色、大小等挑取不同的菌落進行純化。

(3) 消毒方法有效性的檢測 吸取最后一次清洗過材料的水0.2 mL涂布在培養(yǎng)基上作為對照，將平板于28 ℃培養(yǎng)3周以上，觀察是否有菌落長出。以此方法來檢測此消毒方法是否將蘇鐵珊瑚根表面消毒干凈。

1.2.3 蘇鐵珊瑚根內生放線菌的鑒定

用SDS法[6]對分離到的放線菌進行DNA提 取， 然 后 用 引 物: Primer A:5’-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3’；Primer B:5’-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3’(北 京 三 博 公司合成)對16S rRNA進行擴增。PCR反應條件：95℃預變性5 min，95℃變性1 min，54℃退火1 min，72℃延伸2 min，共30個循環(huán)，最后72℃延伸10 min。取PCR產物5 μL于1%瓊脂糖凝膠電泳(電壓100 V)30 min，放置于凝膠成像系統(tǒng)中檢測照相。

2 結果與分析

2.1 蘇鐵珊瑚根的外部形態(tài)觀察

蘇鐵珊瑚根生長于尚未木質化的幼根組織上，大多產生于生產側根的部位。觀察培養(yǎng)出的幼苗發(fā)現(xiàn)，珊瑚根瘤瓣在向外突出根的表皮時往往不是一個瘤瓣，而是多個瘤瓣同時突出根的表皮，呈簇狀生長。這時的珊瑚根顏色還是同其著生部位的根的顏色完全一致，呈乳白色。隨著瘤瓣的生長，不斷進行二叉分枝，最終形成多分枝的球形珊瑚狀瘤簇，大多在地表下2～5cm處或裸露于地表（見圖1）。形成的瘤簇直徑可達2～3 cm以上。成熟的蘇鐵珊瑚根由于藍細菌的入侵而使得表面呈藍綠色，老的周皮上具明顯的皮孔，每個二叉狀分支長約1 cm，直徑約0.15～0.2 cm（見圖2）。

2.2 蘇鐵珊瑚根顯微結構觀察

圖1 蘇鐵珊瑚根Fig.1 The cycad coralloid roots

圖2 蘇鐵珊瑚根(皮孔和長度) Lc =lenticelFig.2 The cycad coralloid root (lenticel and length)Lc =lenticel

蘇鐵珊瑚根橫切面呈近橢圓形，由周皮、外部皮層、藻胞層、內部皮層和維管柱組成（見圖3）。藻胞層的細胞多為徑向延長的大細胞，排列緊密，整個藻胞層被番紅和固綠染成了鮮紅色，這是由于大量的藍細菌宿住在此區(qū)域。根橫切面中空而無法看到完整的維管柱。外部皮層和內部皮層薄壁細胞在橫切面上呈近圓形，而且在有的細胞中能看到被染成暗紅色的菌絲團的存在。在縱切面上同樣可以看到在內外皮層有的細胞中存在被染成暗紅色的菌絲團，菌絲團大小不一。（見圖3、4）。

2.3 蘇鐵珊瑚根內生放線菌的分離和鑒定結果

利用M1、M2和M3 3種培養(yǎng)基從蘇鐵珊瑚根共分離到13株菌。用SDS法[6]提取總DNA，提取的總DNA在19 kb以上。對提取的DNA進行純化后，用PA和PB引物對其進行PCR擴增后，擴增出的片段大小約為1 500 bp。將PCR產物送北京三博公司測序。測得16S rRNA用DNAMAN軟件拼接后，用Eztaxon Server 2.1進行序列比對，在GenBank上找到同源序列，各菌株與近源菌相似性見表1。再用Mega 4.0軟件中的Neighbor-Joining法進行系統(tǒng)發(fā)育分析（見圖5）。根據(jù)16S rRNA序列相似性達到98%以上的認為是一個種，達97%以上則認為是同一個屬[7]，若序列相似性小于96%～97%的可以認為不是同一個種，小于93%～95% 的可以認為不是同一個屬[8]的劃分，可以得出這13株菌屬于鏈霉菌菌屬Streptomyces和擬諾卡氏菌屬Nocardiopsis。

圖3 蘇鐵珊瑚根的橫切面結構Fig. 3 The cross section structure of coralloid root in Cycas

圖4 蘇鐵珊瑚的縱切面結構Fig.4 The longitudinal section of coralloid Root in Cycas

3 討 論

3.1 蘇鐵珊瑚根顯微結構

蘇鐵珊瑚根由周皮、外部皮層、藻胞層、內部皮層和維管柱組成。外部皮層和內部皮層在橫切面上呈圓形。藻胞層的細胞多為徑向延長的大細胞，排列緊密。這些結構特征都與蘇建英等[4]報道的相一致。艾素云[9]等對珊瑚根進行了解剖學研究，探究了其結構和發(fā)育起源，但沒有報道除藍細菌外的其它微生物宿住其中的現(xiàn)象。本研究通過石蠟切片法對蘇鐵珊瑚根結構觀察發(fā)現(xiàn)，在皮層細胞中有被番紅染成暗紅的菌絲團的存在且大小不一。菌絲團可能是菌絲纏繞著細胞核生長形成的。而這些菌絲團是否為真菌或放線菌還有待于進一步的研究。2004年，Jack B. Fisher等[10]報道Zamia pumila根中存在著真菌，并觀察到了叢枝。但這與本研究在蘇鐵珊瑚根中看到的菌絲團又存在一定的差異。因此，我們推測蘇鐵珊瑚根中菌絲團的形成很可能是內生放線菌侵染形成的。

表1 蘇鐵珊瑚根中可培養(yǎng)內生放線菌16S rRNA系列分析結果Table 1 16S rRNA sequence analysis results of cultivable endophytes actinomycetes in cycad coralloid root

圖5 根據(jù)16S rRNA基因系列構建部分菌株系統(tǒng)進化樹Fig. 5 Neighbor-joining phylogenetic tree based on almost-complete 16S rRNA gene sequences

3.2 蘇鐵珊瑚根內生放線菌

本研究分離到的13株菌中11株為鏈霉菌屬Streptomyces，占總數(shù)的84.6%，說明蘇鐵珊瑚根內生放線菌的優(yōu)勢種群是鏈霉菌。這與已有的報道大多數(shù)的內生放線菌大部分都是鏈霉菌屬[11-12]相符。利用M1和M2均分離到了兩屬，而M3只分離到一屬，說明M1和M2對分離蘇鐵珊瑚根內生放線菌優(yōu)于M3。但3種培養(yǎng)基分離到的種屬都比較單一，可能是蘇鐵珊瑚根中可培養(yǎng)內生放線菌種類較少，有待于用不同方法對其進行分離。

放線菌生長緩慢，往往由于真菌和細菌的干擾而無法成功分離到。要成功分離到放線菌，必須在培養(yǎng)基中加入一些能抑制真菌和細菌的生長但又不影響放線菌生長的抑制劑。本研究選取了高效又便宜的抑制劑重鉻酸鉀，當在養(yǎng)基中加入100 mg/L的重鉻酸鉀時，能夠有效的抑制真菌和細菌的生長，這與徐麗華等[13]的報道相一致。

另外，植物材料的預處理對于內生菌的分離也至關重要。本研究是直接采用的新鮮植物材料進行分離，效果不是很理想，分離到的種屬較少，要分離到盡可能多的內生放線菌可能還要采取不同的預處理方法。

弗蘭克氏菌屬Frankia是最早被發(fā)現(xiàn)的能在非豆科植物根部形成根瘤并具有固氮能力的內生放線菌。而放線菌在蘇鐵中具有什么樣的作用，以及其侵染途徑和機制目前還不清楚。曹理想[14]等認為內生鏈霉菌不僅可促進植物生長、提高作物產量、而且可以增加植物對病原菌的抗性。筆者在野外調查時也發(fā)現(xiàn)具有珊瑚根的植株比沒有珊瑚根植株要生長旺盛并且病蟲害侵染相對較少，但蘇鐵珊瑚根中的內生鏈霉菌是否也能夠促進蘇鐵的生長和增強蘇鐵對病原物的抗性還有待證實。

[1] 國家林業(yè)局、農業(yè)部令（1999）第4號, 《國家重點保護野生植物名錄（第一批）》, 1999.

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Structural observations of Cycas revolute coralloid root and disassociation of endophytic actinomycetes

CAO Yan1, WU Jian-rong2
(1. Key Lab. of Forest Disaster and Warning Control of Yunnan Province University, College of Forestry, Southwest Forestry University,Kunming 650224, Yunnan, China; 2. Key Lab. of Biodiversity Conservation in Southwest China of State Forestry Administration,Kunming 650224, Yunnan, China)

Cycad is the most primitive extant gymnosperms, which is considered to be living fossil. In order to explore the structure and the endophytes actinomycetes of cycad coralloid root, the paraffin section was used to do the observation on microstructure; TWYE（M1）,Gao one (M2) and Glycerin – asparagine mediums were used to seprate the endophytic actinomycetes in the coralloid roots and through 16S rRNA sequence analysis, the Actinomycetes were identified. The results indicate that the periderm, outer cortex, cyanobacterial zone, internal cortex and vascular cylinder consisted of the cycad coralloid root; the cells of the external and internal cortex presented to be a circular form on the cross section, and pelotons that were stained to be red existed in some cells of them. 13 strains of actionmycetes were separated from the cycad coralloid root through the above three mediums, and they belong to streptomyces and nocardiopsis.

Cycas revoluta; coralloid root; endophytic actionomycetes; disassociation; 16S rRNA

S791.11;Q939

A

1673-923X(2012)11-0047-04

2012-10-10

國家“十一五”科技支撐計劃重點項目(2008BAC39B05)；西南林業(yè)大學重點科研基金項目（BC2010FK01）；云南省重點學科森林保護學(XKZ200905)

曹 妍（1987-），女，江西吉安人，碩士研究生，研究方向：森林保護學與資源微生物利用；E-mail:caoyan_612@163.com

伍建榕(1963-)，女，福建人，教授，主要從事森林病理學及資源微生物利用研究；E-mail: wujianrong63@Yahoo.com.cn

[本文編校：吳 毅]