樟子松愈傷誘導及植株再生的初步研究

張文泉，閆 偉

樟子松愈傷誘導及植株再生的初步研究

張文泉，閆 偉

（內蒙古農業大學 林學院，內蒙古 呼和浩特 010019）

以樟子松成熟胚為外植體，研究不同生長調節劑組合對樟子松愈傷組織誘導及分化的影響，并獲得了完整的再生植株。結果表明：誘導愈傷組織的最佳培養基組合為MS+1.5 mg/L 2,4-D +0.5 mg/L 6-BA，愈傷組織分化的最佳培養基組合為MS+ 0.2 mg/L IAA +1.5 mg/L 6-BA，樟子松不定芽伸長生長的適宜基本培養基為1/2MS＋0.1%活性炭，誘導生根的最佳培養基組合為1/4MS+0.5 mg/L NAA+0.2 mg/L IBA。

樟子松；組織培養；植株再生

樟子松Pinus sylvestris var. mongolica Litv.是松科松屬高大常綠喬木樹種，是歐洲赤松的一個地理變種，其材質良好，防風固沙作用顯著，具有抗寒、抗旱、耐貧瘠、適應性強且較速生等特點，是我國北方主要造林和防風固沙樹種。但樟子松結實間隔期長，籽粒空癟率高，種子不能很快滿足生產上的需要[1]，組織培養作為一項生物技術為快速繁殖松屬樹種提供了一條有效的途徑。當前國內對樟子松離體培養雖有研究，但至今未有對其愈傷誘導途徑的報道，因此，對樟子松愈傷誘導及植株再生研究具有一定的理論和實踐意義[2-8]。本研究以樟子松成熟胚為外植體, 誘導產生愈傷組織后, 愈傷組織分化獲得到再生植株, 建立了植株再生體系。

1 材料與方法

供試材料種子采自內蒙古自治區呼倫貝爾市鄂溫克族自治旗紅花爾基樟子松國家森林公園。

1.1 供試外植體

供試材料為樟子松成熟胚。

1.2 實驗方法

1.2.1 材料消毒

精選的種子用 30℃左右溫水浸泡 24 h，0.5 %KMnO4溶液消毒 10～20 min，在超凈工作臺上剝去外殼，無菌水沖洗干凈后，用75%酒精表面消毒 1 min，無菌水沖洗 2 次，之后再用 10%的NaClO 溶液消毒 20 min，無菌水沖洗 5～6 次，用無菌濾紙吸去表面水分。于無菌條件下用細鑷子剝去胚乳,取出成熟種胚用于接種。

1.2.2 愈傷組織的誘導

將成熟種胚接種到以 1/2MS 為基本培養基，附加 20 g/L 的蔗糖、8 g /L 的瓊脂、不同質量濃度的2,4-D(0.5,1.5,2.5 mg/L)與 6-BA(0.5 ,1.0 ,1.5 mg/L)組合，NAA（0.5 ,1.0 mg/L）與 6-BA(0.5 ,1.0 ,1.5 mg/L)組合，pH值調至 5.8 的培養基上誘導愈傷組織。黑暗處理 15 d 后，轉移至光強為1 500 Lx 的光照條件下培養，培養時間為16 h/d，培養溫度為 (25±1) ℃。每處理接種 32個外植體。20 d 后觀察統計愈傷組織誘導率。

1.2.3 愈傷組織的分化

將獲得的愈傷組織轉移至 1/2MS 為基本培養基，附加 20 g/L 的蔗糖、8 g /L的瓊脂、不同質量濃度的 6-BA(0.5,1.0,1.5,2.0 mg/L)與 IBA（0.2,0.5 mg/L）組合培養基上，pH 值調至 5.8，誘導不定芽，35 d 后統計愈傷組織分化情況及平均芽數。

不定芽誘導率=(產生不定芽的愈傷組織數/接種愈傷組織數總數)×100 %;

平均不定芽數＝不定芽總數/被誘導的胚數。

1.2.4 芽的伸長

將獲得的不定芽接入伸長培養基中，芽伸長采用 1/2MS 為基本培養基，附加20 g/L 的蔗糖，8/L 的瓊脂，添加不同質量濃度的活性炭 (0，0.03，0.05 ，0.1，0.15 ，0.2 mg/L)的培養基，pH值調至 5.8，不加任何激素。選擇合適的活性炭質量濃度。

1.2.5 不定根的誘導

將高 1 cm 左右的芽接種到生根培養基上進行根的誘導。生根培養基以1/2MS、1/4MS 為基本培養基, 附加 20 g/L 的蔗糖、8 g/L 的瓊脂，添加不同質量濃度的萘乙酸(NAA)和吲哚乙酸(IBA),40 d 后統計生根情況。

不定根誘導率=(產生不定根的芽數/接種芽總數)×100 %。

2 結果與分析

2.1 愈傷組織的誘導和外植體選擇

以樟子松成熟胚作為外植體，7 d后成熟胚均有愈傷組織產生，成熟胚膨大,葉面卷曲,開始出現肉眼可見的愈傷組織。樟子松成熟胚形成的愈傷組織從形態上可分為兩種類型：一種是淡黃色、光滑致密、球狀突起的愈傷組織，后轉為綠白色（見圖1）；另一種是形成了不規則的黃白色，質地較為疏松的愈傷組織（見圖2）。從愈傷組織誘導正交試驗結果直觀分析 (見表1) 表明, 愈傷誘導過程中細胞生長素2，4-D與NAA比較，2，4-D較優于NAA。從表1可以看出,不同實驗中的誘導結果有很大差異,其中水平組合為第2組實驗中誘導效果最好，誘導率為91.6 %。

本試驗篩選樟子松愈傷組織誘導培養基為MS+ 1.5 mg/L 2,4-D +0.5 mg/L 6-BA。

圖1 成熟胚形成的愈傷1Fig.1 Foraminate callus in mature embryo 1

圖2 成熟胚形成的愈傷2Fig.2 Foraminate callus in mature embryo 2

2.2 愈傷組織的分化

愈傷組織接入分化培養基上培養，光照培養15 d左右，已經出現了分化的跡象。繼續培養20 d后，部分愈傷組織上形成綠色的芽點，芽點進一步發育35 d左右，形成不定芽或芽叢。每塊愈傷組織上不定芽的數量多少不等，有的僅形成1個不定芽，最多的可達7個（見圖3）。其中不同質量濃度的激素對愈傷組織的分化存在較大差異（見表2），當6-BA為1.5 mg/L、IAA為0.2 mg/L時，出芽率最高。因此，本試驗中樟子松愈傷組織分化的培養基為MS+6-BA 1.5 mg/L +IAA 0.2 mg/L。

表1 外植體在不同激素質量濃度的 MS 培養基上愈傷形成率?Table 1 Effects of different hormone and different concentration of hormone in MS medium on inductivity of callus

圖3 形成多個不定芽Fig.3 Adventitious bud in vitro shoot

表2 不同質量濃度的激素組合對愈傷組織分化的影響Table 2 Effects of different hormone and different concentration on callus differentiation

2.3 芽的伸長

大量組織培養試驗證明活性炭對芽的伸長生長具有一定的促進作用，本試驗結果（見圖4）表明，活性炭的加入對樟子松不定芽的生長與伸長具有一定的促進作用，不同濃度活性炭的加入對芽伸長存在顯著性差異，當加入的活性炭濃度為0.1%時，最有利于叢生芽苗的伸長生長，當活性炭濃度高于這個值后芽的伸長生長開始受到抑制，這可能是由于活性炭在吸附有害物質的同時也吸附了礦質元素。因此，在樟子松叢生芽的伸長生長過程中，加入0.1%的活性炭較為適宜（見圖5）。

圖4 芽的伸長生長Fig.4 Elongation growth of bud

圖5 活性炭對不定芽伸長生長的影響Fig.5 Influence of activated charcoal on growth of adventitious buds

2.4 不定根的誘導

將高1 cm左右的芽接種到生根培養基上進行根的誘導，1周后觀察到部分無根幼苗莖基部有愈傷組織產生，隨后形成不定根，2周后即可獲得完整的再生植株(見圖6，7)，4周時，根長可達1.5 cm左右。不定根誘導試驗結果（見表3）表明：培養基中大量元素質量濃度對樟子松芽的生根具一定的影響,降低培養基中的大量元素質量濃度有利于樟子松不定芽的生根,1/4MS培養基對樟子松不定芽生根最為有效,在以1/4MS為培養基且不加任何激素的情況下,培養一段時間偶爾有不定根產生。培養基中單獨加入生長素可明顯提高不定芽的生根率，NAA的效果比IBA好,在含有NAA的1/4MS生根培養基中同時加入低質量濃度的IBA對樟子松不定根的誘導有明顯的促進作用，生根率達60 %。

圖6 根系誘導Fig.6 Roots induced

圖7 完整的再生植株Fig.7 Complete regeneration plant

表3 不同培養基和 NAA、IBA 對不定根誘導的影響Table 3 Effects of different media with different NAA and IBA on adventitious root inductions

3 討 論

植物形成愈傷組織后，再分化形成完整植株,在離體植物快繁中是普遍存在的現象[9-11]。關于樟子松通過此途徑獲得再生植株的研究，國內外尚未見報道, 本試驗研究表明，利用樟子松成熟胚作為外植體，通過脫分化形成愈傷組織，再分化形成不定芽而產生再生植株。

其中培養基配方正確與否直接影響著外植體的脫分化與再分化[12]，特別是各種誘導培養基和8 種不同的愈傷組織分化培養基。激素的調配也尤為重要，本實驗設計了15種不同的誘導愈傷組織的激素組合，其中以 2,4-D 1.5 mg/L 和 6-BA 0.5 mg/L 培養基的愈傷組織形成率較高, 而且在愈傷誘導過程中，2,4-D 對樟子松的影響大于 NAA，6-BA 為 1.0 mg/L、IAA 為 0.2 mg/L 時，出芽率最高，且與其它培養基存在顯著差異，明顯表現出激素組合的優勢。

為了使增殖后的芽苗進一步伸長生長，可利用去掉植物激素，降低礦質鹽、維生素及蔗糖等方法[13]，附加吸附物質如活性炭，對芽的生長也有促進作用[14]。

本研究表明，在以 1/2MS 為基本培養基，去掉植物激素的情況下，附加 0.1%的活性炭對樟子松不定芽的伸長生長起到良好的促進作用，這也許與活性炭在一定程度上吸附了不定芽在生長過程中代謝出的有害物質有關，與齊力旺等[15]對油松封頂芽的組織培養，鄭均寶等[16]對油松離體胚子葉的組織分化和無根試管苗，闕國寧等[17]對火炬松、濕地松、晚松組培繁殖的研究結果一致。

針葉樹組織培養中誘導生根往往比較困難，生根率低嚴重制約著針葉樹的離體快速繁殖。促進針葉樹生根的方法通常有：降低培養基無機鹽的質量濃度、降低蔗糖的質量濃度、加入不同種類和配比的激素、培養基中加入活性炭、誘導前期用激素進行刺激、試管外生根等[18-24]。本試驗結果表明，基本培養基、生長素種類和質量濃度等對樟子松不定芽生根有較大影響。培養基中大量元素含量減半（由1/2MS降到1/4MS）有利于樟子松不定根的誘導，1/4 MS培養基對誘導樟子松不定芽生根效果較好，在不含生長素的情況下偶爾有不定根產生，這與Thorpe總結針葉樹中再生植株形成過程中芽生根的結論一致。

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Preliminary study on calliferous induction and plant regeneration of Pinus sylvestris var. mongolica Litv

ZHANG Wen-quan, YAN Wei
(Forestry College, Inner Mongolia Agricultural University, Huhhot 010019, Inner Mongolia Autonomous Region, China)

The effects of various combination of growth regulating agents on the callus induction and differentiation of mature embryo of Pinus sylvestris var. mongolica Litv were studied, and complete regeneration plant was established. The results indicate that the optimum medium for callus induction from leaves was MS+ 1.5 mg/L 2,4-D+0. 5 mg/L 6-BA; the optimum medium for callus differentiation was MS+ 0.2 mg/L IAA + 1.5 mg/L 6-BA; the best medium for increasing the height of cluster buds was 1/2MS+0.1% activated carbon and the adventitious root was induced on 1/4 MS++0.5 mg/L NAA+0.2 mg/L IBA.

Pinus sylvestris var. mongolica Litv；tissue culture；plant regeneration

S791.253; Q943.1

A

1673-923X(2012)11-0037-05

2012-05-20

國家自然科學基金項目（31060111）

張文泉（1984-），男，湖南婁底人，博士研究生，主要從事林木菌根生物技術方面的研究

閆 偉（1959-），男，內蒙古呼和浩特人，教授，博士研究生導師，主要從事林木菌根生物技術方面的研究；E-mail：weiyan @imau.edu.cn

[本文編校：謝榮秀]