丹參川芎嗪注射液對TNFα干預血管內皮細胞損傷ET-1和ICAM-1基因表達的影響

汪 偉 呂清國 (長春大學，吉林 長春 30022)

1.4 逆轉錄反應 按Toyobo逆轉錄試劑盒使用說明進行操作，逆轉錄反應條件為 37℃變性15 min，95℃ 5 min。產物－20℃保存或立即進行下一步PCR反應。

1.5 實時定量熒光PCR反應 按照Toyobo SYBR實時PCR試劑盒操作說明，加入 4.8 μl ddH2O、10 μl SYBR、0.6 μl上游引物、0.6 μl下游引物和4 μl cDNA。反應條件為：95℃預變性15 s;95℃ 5 s，60℃ 15s，72℃ 20 s 45 個循環。Roche 480 PCR儀上進行定量分析。以正常對照組作為標準，其他組與其進行比較，換算成百分率。

動脈粥樣硬化(AS)是一種慢性炎癥性疾病，各種危險因素引起細胞釋放腫瘤壞死因子(TNF)和白細胞介素等細胞因子作用在內皮細胞上，內皮素(ET)的分泌增加導致內皮細胞功能受損，內皮細胞上的細胞間黏附因子(ICAM)-1表達增加，導致單核細胞黏附在血管內皮細胞上，進一步的促使AS發生和發展。活血化瘀中藥具有抗血管內皮損傷、防治AS的作用〔1〕。采用活血化瘀法干預AS的發生發展能夠取得良好的效果〔2〕。丹參川芎嗪注射液是根據中醫活血化瘀的原理，以丹參和川芎為主的中草藥經過現代科學技術方法加工制成，其主要成分為丹參素和川芎嗪。臨床廣泛應用于閉塞性腦血管疾病，如腦供血不足、腦血栓形成、腦栓塞及其他缺血性心血管疾病，如冠心病的胸悶、心絞痛、心肌梗死、缺血性腦卒中、血栓閉塞性脈管炎等的治療當中。本文采用炎癥因子TNF-α干預致人臍靜脈內皮細胞ECV304損傷，模擬AS時血管內皮受損的情況，探討丹參川芎嗪注射液對與內皮細胞功能密切相關的ET-1和ICAM-1表達的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 丹參川芎嗪注射液由貴州拜特制藥有限公司生產。人臍靜脈血管內皮細胞株ECV304購于武漢大學中國典型培養物保藏中心。RPMI-1640培養基為Gibco公司產品，胎牛血清為 PAA公司產品。TNF-α為 Invitrogen公司產品。TRNzol總RNA提取試劑為Tiangen公司產品。逆轉錄試劑盒和實時定量熒光PCR試劑盒為Toyobo公司產品。引物由TAKARA公司設計和合成。

1.2 細胞培養 人臍靜脈血管內皮細胞ECV304的培養基為RPMI-1640加10%胎牛血清及1%雙抗(10 000 U/ml青霉素、10 000 μg/ml鏈霉素)，在 37℃、5%CO2飽和濕度環境下培養、傳代，以備實驗使用。

1.3 總RNA的提取 分別收集各組細胞(正常對照組、TNF-α干預組、TNF-α+注射液組)，棄去上清，直接在培養板中加入1 ml TRIzol裂解細胞，反復吹打，直至無肉眼可見沉淀，轉移至1.5 ml離心管中，室溫靜置5 min;加入0.2 ml氯仿，劇烈搖蕩15 s，室溫靜置3 min;4℃ 10 000 r/min離心15 min，轉移最上層到另一離心管中;加入500 ml異丙醇，混勻，室溫靜置20 min;4℃ 10 000 r/min離心10 min，去上清;棄去上清，加入

2結果

TNF-α導致ECV304細胞ET-1和ICAM-1基因表達增加，丹參川芎嗪注射液能夠抑制TNF-α所導致的ET-1和ICAM-基因表達的增加，隨著注射液濃度的增大，抑制程度逐漸加強。見表1。

表1 ECV304細胞中ET-1基因的表達(x ± s，%)

3討論

血管內皮既是感知器官，同時又是效應器官。它作為中介，在感受血流壓力變化、炎性信號及循環體系中的激素水平的同時，作出相應的反應，調節血管舒縮狀態，從而維持平衡。血管內皮合成并釋放血管舒張因子〔如一氧化氮(NO)〕和收縮因子(如ET-1)，通過自分泌、旁分泌、內分泌作用調節局部和全身血管的張力。血管內皮細胞的絕大多數功能與它能產生、釋放、活化多種不同作用的生物活性物質相關〔3〕。

內皮細胞功能障礙是AS疾病的發病基礎。當血管內皮細胞受到各種危險因素如高血壓、高血脂和免疫損傷時，循環系統中的TNF和白細胞介素等細胞因子使得內皮細胞功能受到破壞，持續的刺激形成慢性內皮細胞活化狀態，內皮細胞表達的生物活性物質數量或功能發生改變〔4〕。ICAM-1幾乎參與了單核細胞黏附和遷移轉化的全過程，當血管內皮細胞受到損傷時，刺激ICAM-1表達增加，促進和加速了AS發生和發展〔5〕。

中醫稱AS為“脈絡痹”。血瘀證與血管內皮損傷有著密切聯系，利用活血化瘀藥可以調節血管內皮細胞的內環境及其分泌功能，從而調節內皮功能。活血化瘀中藥具有抗血管內皮損傷、防治AS的作用〔1〕且取得良好的臨床效果〔2〕。

丹參可以明顯抑制AS板塊的形成，可以調節血管內皮細胞生成而產生抗AS的作用〔6〕。丹參素是丹參的主要有效成分，具有改善微循環、促進纖維蛋白溶解、降低全血黏滯度、改善血液流變性及微循環障礙等作用〔7〕。川芎味辛性溫，功能為活血祛瘀、行氣開郁、祛風止痛。川芎嗪是川芎的有效成分，化學結構為四甲基吡嗪，具有擴張微血管、改善微循環、降低血黏度、改善血液流變學、降低毛細血管通透性、延緩AS發生發展及抗炎等作用，在防治心腦血管疾病等方面的防治中具有重要的作用〔8～10〕。

本文結果可見，丹參川芎嗪注射液在臨床上的抗動脈粥樣硬化作用與其對內皮細胞功能的保護作用密不可分。

1 周義杰，張 圻.活血化瘀法對動脈粥樣硬化炎癥損傷的干預機制研究進展〔J〕.廣西中醫學院學報，2010;13(4)：71-3.

2 魏自敏.活血化瘀法干預動脈粥樣硬化的臨床研究〔J〕.光明中醫，2011;2(26)：277-8.

3 Pinto VL，Brunini TM，Ferraz MR，et al.Depression and cardiovascular disease：role of nitric oxid〔J〕.Cardiovasc Hematol Agents Med Chem，2008;6(2)：142-9.

4 Nitenberg A.Hypertension，endothelial dysfunction and cardiovascular risk〔J〕.Arch Mal Cocur Vaiss，2006;99(10)：915-21.

5 Ross R.The pathogenesis of atherosclerosis：a perspective for the1990s〔J〕.Nature，1993;362(6423)：801-9.

6 孟振行，朱甫祥，韓彩麗，等.丹參家兔實驗性動脈粥樣硬化預防作用的研究〔J〕. 心肺血管病雜志，1995;14(2)：101-4.

7 楊繼英.丹參素的藥理作用研究進展〔J〕.中華臨床醫學雜志，2007;8(4)：45-6.

8 梅家俊，蔡大勇，陳振發，等.川芎防治家兔動脈粥樣硬化病變機理的研究〔J〕.微循環學雜志，2000;10(3)：52.

9 任志強，孫蘭軍.川芎嗪的心血管藥理作用〔J〕.中西醫結合心腦血管病雜，2008;6(5)：571-2.

10 吳紅金，呂俊萍，馬增春，等.川芎嗪對培養人臍靜脈內皮細胞基因表達譜的影響〔J〕.中國實驗方劑學雜志，2005;11(3)：40-3.