5-氟尿嘧啶聯合熱療體外誘導Hep-2細胞凋亡及細胞周期阻滯

蔡 郁 蔡 敏 王文華 張步勇 徐艷萍 (吉林大學第二醫院耳鼻咽喉頭頸外科，吉林 長春 130041)

喉癌是我國北方地區常見的惡性腫瘤，發病率占頭頸腫瘤的15%～20%，由于其發病部位受生理解剖特點的影響，手術很難徹底切除病灶，因此，非手術的綜合治療近年來倍受關注。熱療作為治療手段之一，因其毒副作用反應低，與放療、化療等有協同作用，不僅用于無法手術切除的腫瘤患者，而且還可以用于腫瘤切除術中或術后治療微小轉移灶〔1〕。

1 材料與方法

1.1 細胞及試劑 Hep -2細胞株由吉林省腫瘤研究所惠贈，噻唑藍(MTT)試劑及RPMI1640培養基購于美國sigma公司，胎牛血清購于長春生物制品研究所，5-氟尿嘧啶(5-FU)廣州振康醫藥有限公司生產。

1.2 MTT比色法 取對數生長期的人喉癌細胞株Hep-2細胞，調細胞數為2×105/ml，接種于96孔塑料培養板內，每孔100 μl，當細胞增殖達到80%匯合時分組。單純熱療組43℃ ±0.2℃持續加熱40 min，然后移入37℃ 5%CO2培養箱內靜止培養;單純5-FU組，根據預實驗結果，5-FU最適濃度200 μg/ml。聯合組在單純5-FU組基礎上再加熱40 min，然后移入37℃CO2培養箱靜止培養24 h，于結束前6 h加入MTT試劑20 μl/孔，終濃度為500 mg/L，繼續培養6 h后，吸棄上清，加入二甲基亞砜150 μl/孔，震蕩10 min，用酶標儀于570 nm處測量各孔吸光度A值，按下列公式計算Hep-2細胞增殖抑制率，Hep-2細胞抑制率=(1－加藥孔細胞A值÷對照孔細胞A值)×100%。

1.3 流式細胞術 細胞培養及分組同1.2，不同之處是將96孔板改為25 ml培養瓶，培養結束后細胞經0.25%胰蛋白酶消化，收集細胞。磷酸鹽緩沖液(PBS)洗2次，70%冷乙醇固定，上機前過40目網調細胞數1×106/ml，碘化丙啶(PI)染色，流式細胞儀檢測，以Modifi2.0軟件分析細胞周期。

1.4 統計學方法 應用SPSS11.0統計軟件進行分析，數據結果以表示，組間比較采用F檢驗。

2 結果

2.1 MTT實驗結果 不同條件對Hep-2細胞增殖抑制率均有影響，各實驗組與對照組相比差異顯著，尤以聯合組效果最佳。見表1。

表1 不同條件下Hep-2細胞增殖抑制率

表1 不同條件下Hep-2細胞增殖抑制率

組別 A值 抑制率(%) P值對照組1.42±0.12 － －單純熱療組 1.24±0.16 13.7 ＜0.01單純5-FU組 1.09±0.19 22.3 ＜0.01聯合組0.76±0.15 46.5 ＜0.01

2.2 流式細胞儀檢測結果 不同條件對Hep-2細胞周期各時相均有影響，阻滯G1期細胞向S期轉化，從而使G2/M期細胞相對增多，凋亡率(AP)升高。見表2。

表2 不同條件下Hep-2細胞周期進程及凋亡率

表2 不同條件下Hep-2細胞周期進程及凋亡率

與對照組比較：1)P ＜0.05，2)P ＜0.01

對照組33.5±2.1 63.7±3.1 2.4±1.9 1.5單純熱療組 45.8±4.21) 42.1±4.81) 12.8±1.91) 7.52)單純5-FU組 52.6±4.41) 27.7±3.21) 19.4±3.22) 13.82)聯合組 61.6±3.72) 13.8±2.32) 24.5±3.52) 17.52)

3 討論

近年來，熱療因其安全有效而逐漸成為繼手術、放療、化療及生物治療后又一腫瘤治療手段〔2〕，被國際抗癌組織稱之為腫瘤“綠色療法”。新近研究表明，熱療配合放療或化療可顯著提高腫瘤的局部控制率及患者的生存率。5-FU為一線抗腫瘤藥物，在體內轉變為氟尿嘧啶脫氧核苷酸與胸腺嘧啶核苷酸酶特異性結合，影響細胞DNA的合成〔3〕，阻滯G1期細胞向S期轉化，從而造成G1期細胞堆積，不能進入S期。此外，由于S期細胞對熱敏感〔4〕，受熱后損傷嚴重，可形成多核細胞，分裂后死亡。熱療也是導致S期細胞減少的主要因素，根據流式細胞儀結果可以初步認為熱療與5-FU聯合應用既能抑制細胞周期G1期的進程，又能抑制S期細胞，從而使G2/M期細胞相對增多。G2/M期是細胞增殖的重要階段，多種DNA損傷劑(如射線、化療藥物等)都可以引起G2/M期阻滯〔5〕。由于G2/M期阻滯在細胞增殖和凋亡中的作用，使人們聯想到它可能與細胞基因組不穩定、腫瘤發生和治療密切相關。

綜上所述，熱療具有直接的細胞毒作用，可使細胞膜的通透性和流動性改變，從而導致細胞內環境發生改變〔6〕，熱療和化療聯合應用具有協同作用，熱療增加細胞膜的通透性，有利于抗腫瘤藥物吸收;此外，熱療改變了藥物的藥代動力學，從而使腫瘤細胞內的藥物攝取量增加，最終誘導細胞凋亡或死亡。

1 高 慧，楊耀琴.熱療與生物治療的聯合抗腫瘤效應〔J〕.國際腫瘤學雜志，2009;36(3)：193-5.

2 郝麗莉，盛延良，王淑秋，等.腫瘤熱療的研究進展〔J〕.現代生物醫學進展，2008;8(4)：772-4.

3 盛雅萍，郭偉劍.5-氟尿嘧啶耐藥機制及其治療〔J〕.國際腫瘤學雜志，2006;33(7)：502-5.

4 Martin LG，Demers GW，Galloway DW.Disruption of the G1/S transition in human Papilloma-virus type16 E7-expressing human cells in associated regulation of cyclin E〔J〕.J Virol，1998;72(2)：975-85.

5 Eillnger-Ziegelbauer H，Karasuyama H，Yamada E，et al.Ste20-like kinase(SLK)，a regulatory kinase for polo-like kinase(PLK)during the G2/M transition in somatic cells〔J〕.Genes Cells，2000;5(6)：491-8.

6 Jie KG，Jiang H，Sun L，et al.The pilot study of anti-tumor effects versus immunosuppression of Staphylococcal Enterotoxin C〔J〕.Cancer Biol T-her，2007;6(10)：1584-91.