子宮內膜樣腺癌中KLK7、E-Cad的表達及其與病情的相關性

白 蘭 王迪迪 王春敏 姚海濤 盧北燕 朱貴明 佟秀鳳 張 燕 佟麗波

(佳木斯大學附屬第一醫院，黑龍江 佳木斯 154000)

子宮內膜癌因確切病因及發病機制仍不明確，疾病的浸潤和轉移一直都是困擾治療的難題。所以從多種途徑早期發現和針對其早期浸潤轉移入手進行有針對性的治療是治療成敗的關鍵。近年來有關人角化層糜蛋白酶(KLK7)、E-鈣黏蛋白(E-Cad)在某些腫瘤的浸潤和轉移中起到的作用已引起人們注意〔1～3〕，但在子宮內膜癌中研究較少。本研究檢測KLK7蛋白、E-Cad在子宮內膜樣腺癌組織中的表達情況，分析其與臨床病理指標的相關性，探討兩者表達狀況與病情進展及侵襲轉移的相關性。

1 材料與方法

1.1 研究對象 收集2010年8月至2011年5月在佳木斯大學第一附屬醫院婦產科進行初次手術治療的子宮內膜樣腺癌30例;增生期子宮內膜10例、子宮內膜不典型增生10例，均來自因不規則陰道流血行刮宮術的標本。所有病人術前均未接受放、化療及激素治療，年齡30～80歲，平均55歲，其病程差異無統計學意義。切除組織均經病理學證實診斷。子宮內膜癌按照FIGO(2009)標準分期，組織學分級參照WHO標準。手術切除標本離體后立即自子宮內膜原發病灶分離出腫瘤組織，液氮速凍后轉至－80℃冰箱保存備用，其余部分送病理檢查。

1.2 儀器及試劑 兔抗人KLK7多克隆抗體及兔抗人E-Cad多克隆抗體(北京博奧森公司)，儀器由佳木斯大學生物化學實驗室提供。

1.3 方法 取子宮內膜癌組織及其他各組組織各50 μg/孔，10%十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳，用干轉儀轉移蛋白質到硝酸纖維素膜上，5%脫脂奶粉封閉膜1 h后，分別加入1∶1 000兔抗人KLK7抗體，1∶500兔抗人E-Cad抗體，室溫搖床1 h，4℃孵育過夜;加入二抗，室溫搖床1 h，ECL顯色。

1.4 統計學方法 應用SPSS11.0統計分析軟件進行分析。各組間計數資料采用χ2檢驗，不滿足χ2檢驗應用條件的采用Fisher精確概率計算法。計量資料兩組比較采用t檢驗，多組比較采用方差分析，兩兩比較采用snk-q檢驗。相關分析采用Spearman等級相關分析。

2 結果

2.1 Western印跡結果 KLK7蛋白在28 kD、E-Cad在97 kD處可見特異性抗體結合蛋白表達條帶。參照β-actin表達條帶吸光度值，在蛋白上樣量一致的前提下，將KLK7、E-Cad與βactin光密度比值作為其相對表達量，進行統計學分析。見圖1。

圖1 子宮內膜組織中KLK7、E-Cad的Western印跡檢測結果

2.2 KLK7和E-Cad相對表達量 增生期子宮內膜、子宮內膜不典型增生及子宮內膜樣腺癌KLK7的相對表達量分別為0.83±0.18、0.94±0.23、1.11±0.17;E-Cad的相對表達量分別為1.03±0.15、0.94±0.10、0.52±0.06。表明 KLK7蛋白在子宮內膜樣腺癌中的陽性表達率及表達水平均顯著高于增生期子宮內膜及子宮內膜不典型增生。E-Cad在子宮內膜癌中的陽性表達率及表達水平均顯著低于增生期子宮內膜及子宮內膜不典型增生。

2.3 KLK7蛋白、E-Cad在子宮內膜樣腺癌中的表達與不同臨床病理指標的關系 KLK7蛋白和E-Cad在子宮內膜樣腺癌組織中的陽性表達率和表達水平與年齡無相關性;KLK7蛋白的陽性表達率和表達水平在臨床晚期、低分化組、淋巴結有轉移者及深肌層浸潤者子宮內膜樣腺癌組織中明顯高于臨床早期、高分化組、淋巴結無轉移及無或淺肌層浸潤者。而E-Cad與KLK7蛋白的表達正好相反。見表1。

2.4 子宮內膜樣腺癌中KLK7和E-Cad表達的相關性 在30例子宮內膜樣腺癌中，KLK7與E-Cad共同陽性9例，共同陰性1例，KLK7陽性、E-Cad陰性14例，E-Cad陽性、KLK7陰性6例。經Spearman等級相關分析表明，KLK7蛋白與E-Cad在子宮內膜樣腺癌中的表達呈負相關(r=－0.394，P＜0.05)。

表1 不同臨床病理指標的子宮內膜樣腺癌組織中KLK7蛋白及E-Cad的表達情況(±s)

表1 不同臨床病理指標的子宮內膜樣腺癌組織中KLK7蛋白及E-Cad的表達情況(±s)

與I期相比：1)P＜0.05;與G1相比：2)P＜0.05;與無或淺肌層浸潤相比：3)P＜0.05;與無淋巴結轉移相比：4)P＜0.01

病理特征 n KLK7蛋白陽性〔n(%)〕表達水平E-Cad陽性〔n(%)〕表達水平年齡＞50歲 13 10(77) 1.18±0.08 12(92) 0.51±0.17≤50歲 17 14(82) 1.17±0.14 10(59) 0.41±0.10手術分期Ⅰ期 19 16(84) 1.07±0.081) 15(79) 0.75±0.17Ⅱ期 6 4(67) 1.23±0.05 4(67) 0.51±0.161)Ⅲ ～Ⅳ期 5 4(67) 1.36±0.101) 3(60) 0.46±0.121)病理分級G1 19 14(74) 1.12±0.07 16(84) 0.73±0.17 G2～G3 11 10(91) 1.31±0.042) 8(73) 0.44±0.102)肌層浸潤無或淺肌層 24 19(79) 1.03±0.10 18(75) 0.75±0.18深肌層 6 5(83) 1.33±0.103) 4(67) 0.40±0.123)淋巴結轉移有 12 11(92) 1.32±0.034) 5(42) 0.36±0.174)無 18 13(72) 1.13±0.07 17(94)0.68±0.17

3 討論

KLK7是人組織激肽釋放酶家族的一個新成員，是一種分泌型絲氨酸蛋白酶。最初的研究發現，KLK7僅存在于角質層中，并由角質層上皮細胞特異性表達，參與皮膚脫屑〔1〕。目前研究發現角化層蛋白酶之間可能存在級聯反應，已證實KLK5可以激活KLK7的前體成為有活性的蛋白酶，最適 pH5～7，KLK7可以直接降解角化細胞間的黏連蛋白，如角化粒蛋白和橋粒糖蛋白〔2〕。絲氨酸蛋白酶作為蛋白降解酶家族的一個成員介導相鄰細胞外基質的消化，促使腫瘤細胞的生長，導致腫瘤細胞脫落到周圍環境中。本研究結果提示KLK7可能是導致腫瘤細胞生長、擴散和轉移的一個高危因素，與Prezas等〔2〕、何霞等〔3〕結果基本一致。結合KLK7在皮膚中的作用是促進角質層細胞脫落機制，進一步推測子宮內膜癌中KLK7在促進癌細胞浸潤和轉移的作用極可能與絲氨酸蛋白酶參與細胞間質的溶解和腫瘤進展中早期瘤細胞脫落有關。

E-Cad屬鈣黏素家族成員，是一種表達于不同組織的依賴Ca2+的同種親和性細胞間黏附分子，為細胞間黏附分子家族的主要成員，廣泛位于上皮細胞間黏附連接處，在建立和維持細胞群體、信號傳導及組織結構完整性等方面起著關鍵作用。ECad是一種跨膜糖蛋白，分為細胞外區、跨膜區、胞漿區，細胞外區為信號肽結構;跨膜區起著膜固定作用，是細胞外區黏附功能所必不可少的;細胞質區與信息傳遞和細胞穩定有關〔4，5〕。腫瘤細胞表面糖蛋白含量下降導致細胞無限制增殖和易轉移機制已被大家所接受。根據本實驗結果分析，當E-Cad在在子宮內膜樣腺癌組織中表達下降時，細胞間的相互黏附力下降，造成細胞容易分散而向外周浸潤性生長;而在生長過程中轉移的必要條件一旦滿足，腫瘤細胞就更易脫離原發灶而發生浸潤和轉移，病情進一步進展和惡化。提示E-Cad在子宮內膜樣腺癌組中表達下降低可能是子宮內膜深肌層浸潤和淋巴結轉移的高危因素。

Johnson等〔6〕研究表明，在胰腺癌組織中hk7與E-Cad之間存在密切關系，即在胰腺癌中hK7通過降減細胞外基質中的E-鈣黏蛋白增強了腫瘤細胞的侵襲轉移能力。本研究結果提示KLK7蛋白與E-Cad表達可能存在某種調控關系，它們協同參與了子宮內膜樣腺癌的發展、浸潤及轉移過程。兩者之間是否有此協同作用及有關在子宮內膜樣腺癌侵襲轉移中是否存在KLK7降減E-Cad這一相互作用機制本實驗尚未涉及，還需應用分子生物學等相關技術進一步研究。

綜上所述，筆者認為在子宮內膜樣腺癌中聯合檢測KLK7及E-Cad的表達有望成為監測子宮內膜樣腺癌患者病情進展及侵襲轉移的指標。但本實驗的樣本量還不足夠多，還需進一步收集病例和實驗。

1 Yamasaki K，Schauber J，Coda A，et al.Kallikrein-mediated proteolysis regulates the antimicrobial effects of cathelicidins in skin〔J〕.FASEB J，2006;20(12)：2068.

2 Prezas P，Arlt MJ，Viktorov P，et al.Over expression of the human tissue kallikrein genes KLK4，5，6and 7 increases the malignant phenotype of ovarian cancer cells〔J〕.Biol Chem，2006;387(6)：807-8.

3 何 霞，羅 梅，薛家強.KLK7蛋白在卵巢上皮性癌組織中的表達及臨床意義〔J〕. 重慶醫學，2009;38(16)：2032-5.

4 Imamura Y，Itoh M，Maeno Y，et al.Functional domains of alpha-catenin required for the strong state of cadherin based cell adhesion〔J〕.Cell Biol，1999;144(6)：1311-22.

5 Heimann R，Lan F，Mebride R，et al.Separating favorable from unfavorable prognostic markers in breast cancer：the role of E-Cadherin〔J〕.Cancer Res，2000;60(2)：298-304.

6 Johnson SK，Ramani VC，Hennings L，et al.Kallikrein 7 enhances pancreatic cancer cell invasion by shedding Ecadherin〔J〕.Cancer，2007;109(9)：1811.