復方芪術湯對四氯化碳致大鼠肝纖維化的影響研究

陸云飛 陳曉蓉 劉成

復方芪術湯對四氯化碳致大鼠肝纖維化的影響研究

陸云飛 陳曉蓉 劉成

目的 探討復方芪術湯對四氯化碳(CCl4)致大鼠肝纖維化藥效的干預作用。方法Wistar雄性大鼠30只，隨機分為正常組10只和四氯化碳處理組(20只)，四氯化碳1 ml/kg，每周2次腹腔注射，正常組注射等量的生理鹽水。造模的第8周，四氯化碳處理組大鼠隨機分為復方芪術湯組和模型組，每組10只。在繼續造模的同時，復方芪術湯組給予70千克成人的10倍量灌胃，模型組給予等量的生理鹽水灌胃，給藥4周。12周末處死全部大鼠，留取肝組織樣本和血清，測定谷丙轉氨酶(ALT)、谷草轉氨酶(AST)、白蛋白(ALB)、總膽紅素(TBiL)。結果 四氯化碳造模12周，模型組血清ALT、AST活性顯著升高;ALB含量顯著下降。血清TBiL含量顯著升高。與模型組相比，復方芪術湯組大鼠血清ALB含量顯著升高，血清ALT和AST活性顯著降低(P＜0.01)。但復方芪術湯對血清TBiL降低不明顯。病理組織學顯示，模型組假小葉形成，肝臟纖維化程度分級均為2、3級;復方芪術湯干預組肝小葉結構不同程度被破壞，肝臟纖維化程度分級大部分在1、2級。結論 復方芪術湯可以顯著改善大鼠肝功能，對CCl4引起的慢性肝纖維化大鼠有很好的降低肝纖維化程度的作用。

復方芪術湯;四氯化碳;肝纖維化;大鼠

Therapeutic effects of Compound Qizhu Decoction on carbon tetrachloride(CCl4)-induced liver fibrosis in rats LU Yun-fei，CHEN Xiao-rong，LIU Cheng.Department of Traditional Chinese Medicine，Shanghai Public Health Clinical Center，Shanghai 201508，China

肝纖維化是指由各種致病因子所致肝內結締組織異常增生，導致肝內彌漫性細胞外基質過度沉淀的病理過程。因該病以“脅部脹痛”、“脅下積塊”等為主要臨床表現，具有中醫瘀血或積聚痞塊的特征，可歸屬于“積聚”等病的范疇。其主要病因病機為正虛血瘀，基于此理論，選擇具有“健脾益氣、活血化瘀”治法的復方芪術湯為代表，觀察其對四氯化碳肝纖維化大鼠的干預作用。

1 材料與方法

1.1 動物

Wistar雄性大鼠30只，清潔級，體重(180±20)g，購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司，生產許可證號:SCXK(滬)2007-0006。上海市公共衛生臨床中心實驗動物中心恒溫飼養，自由飲食、造模和觀察。

1.2 藥物與試劑

復方芪術湯由黃芪30 g、黨參15 g、茯苓15 g、甘草 6 g、赤芍15 g、白芍15 g、丹皮15 g、丹參15 g、紫草15 g組成，所含的生藥均購自上海華宇藥業有限公司，有明確的原產地，經生藥學專家鑒定為正品，按照原方比例和制法由上海中醫藥大學中藥制劑中心一次制備干燥后冷藏。

1.3 肝硬化模型制備

50%的四氯化碳(CCl4)橄欖油溶液1 ml/kg劑量腹腔注射，每周2次，共12周。

1.4 分組與給藥

隨機取10只大鼠作為正常對照組，20只大鼠造模，造模8周末，20只模型大鼠隨機分為模型組和復方芪術湯組，每組10只。復方芪術湯干預組于繼續造模的同時按成人(70 kg)體重用量的10倍，以10 ml/kg大鼠體重的容量灌胃給藥(每g含生藥6.39 g)，每日1 次，連續4 周。

1.5 樣品采集和處理

實驗12周末處死全部大鼠，用7%水合氯醛腹腔注射麻醉后，仰臥位固定，打開腹腔，觀察肝脾的色、質、形態等情況。經下腔靜脈采血，摘取肝脾，稱重，自肝右葉切取10 cm×0.8 cm×0.3 cm肝組織1塊，10%中性福爾馬林固定，脫水、包埋，進行HE染色及天狼星紅染色，觀察肝組織病理變化及肝組織膠原增生程度。血液4℃靜置3小時后，3000轉/分離心30分鐘，分離血清，檢測肝功能指標。

1.6 觀察指標

1.6.1 一般情況 包括大鼠的死亡情況，體重、肝臟大體形態等。

1.6.2 觀察肝組織病理情況 10倍鏡下隨機取4個視野，參照參考文獻方法［1］鏡下檢查肝組織損傷情況，將肝纖維化分為5個等級:“0”表示無纖維化;“1”表示匯管區纖維化擴大，限局竇周及小葉內纖維化;“2”表示匯管區周圍纖維化，纖維間隔形成，小葉結構保留;“3”表示纖維間隔伴小葉結構紊亂，無肝硬化;“4”表示早期肝硬化。

1.6.3 血清肝功能檢測 肝功能指標谷丙轉氨酶(ALT)、谷草轉氨酶(AST)活性及白蛋白(ALB)、總膽紅素(TBiL)含量均由上海市公共衛生臨床中心檢驗科檢測。

1.7 統計方法

計量資料以SPSS 18.0中的ANOVA程序進行單因素方差分析，等級資料采用Riddit分析。

2 結果

2.1 大鼠的死亡率、體重等變化

藥物干預過程中，模型組大鼠死亡3只，復方芪術湯組死亡1只，肝功能衰竭所致。正常組大鼠體重增加平穩，模型組大鼠體重增長相對緩慢，后期體重有所下降，其中有2只因伴有腹腔積液，體重明顯增加。造模第1周起，模型組大鼠體重即顯著低于正常組。藥物干預后，復方芪術湯組體重略有升高，但與模型組相比無顯著性差異。

正常大鼠肝臟顏色紅潤，質地較脆，造模12周結束時，模型組大鼠肝臟增大，色澤較黃，表面呈小結節狀，結節分布均勻，質地較硬、韌。復方芪術湯組大鼠肝臟色澤紅潤，表面較光滑，無明顯結節狀改變，質地較柔軟。正常大鼠脾臟紅暗紅，模型大鼠脾臟暗紅顏色加重，充血，增大，巨脾形成。與模型相比，復方芪術湯組脾重量及脾指數顯著降低，充血程度有所減輕。

2.2 大鼠病理組織學變化

由圖1及表1可見，造模12周后，模型組大部分肝小葉正常結構破壞廣泛，肝細胞索排列紊亂，肝細胞腫大，氣球樣變，肝細胞變性，假小葉形成，肝臟纖維化程度分級均為2、3級。復方芪術湯干預組肝小葉結構不同程度被破壞，部分肝細胞脂肪變性，肝細胞變性范圍較少，肝細胞呈小灶狀壞死，局部細小纖維增生未形成間隔，肝臟纖維化程度分級大部分在1、2級。

表1 復方芪術湯對CCl4大鼠肝纖維化的影響

2.3 大鼠肝功能的變化

與正常組相比，造模12周后大鼠血清 ALT、AST活性、TBiL含量顯著升高(P＜0.01)，大鼠血清ALB含量逐漸降低(P＜0.01)。與12周模型組比較，復方芪術湯組大鼠血清ALT、AST活性顯著降低(P ＜0.01)，ALB 含量顯著升高(P ＜0.01);復方芪術湯對血清TBiL含量降低有一定降低作用，但不顯著(P ＞0.05)。

3 討論

圖1 各組大鼠肝臟病理形態(上圖:天狼星紅染色，×10;下圖:HE染色，×20)

表2 復方芪術湯對CCl4大鼠肝功能的影響

肝纖維化是指肝組織內細胞外基質成分過度增生或異常沉積，導致肝臟結構或(和)功能異常的病理變化，肝纖維化見于大多數不同病因的慢性肝臟疾病中，進一步發展，可形成肝硬化，嚴重影響患者健康與生命。一項前瞻性研究表明，慢性乙型肝炎患者發展為肝硬化的估計年發生率為2.1%，對HBeAg陰性慢性乙型肝炎進行平均9年的隨訪，進展為肝硬化和肝癌的發生率分別為23%和4.4%。代償期肝硬化患者每年發生肝癌的概率為6%。因此，抗肝纖維化是慢性肝病的重要治療措施。傳統中醫學并無肝纖維化概念，多屬于“癥瘕”“積聚”“脅痛”“臌脹”等范疇。肝纖維化的基本證候病機為正虛血瘀［1，2］。李東垣在《醫學發明》中指出:“血者，皆肝之所主，惡血必歸于肝，不問何經之傷，必留脅下。”《臨證指南醫案》也認為“初病在氣，久病入血”。因此，中醫藥防治肝纖維化不僅要活血化瘀，還應重視益氣扶正，攻補兼施。多項研究表明，益氣化瘀類中藥對肝纖維化具有良好的防治作用［3-5］。

上海市公共衛生臨床中心在肝硬化診治中，認為“虛損致瘀”，臨床以復方芪術湯扶助正氣為主，兼以活血化瘀，取得良好療效。該復方以黃芪補氣健脾為君，臣以黨參、茯苓健脾益氣，佐以赤芍、白芍、丹皮、丹參、紫草活血化瘀通絡，使以甘草，調和諸藥，共湊扶正祛邪的作用。

四氯化碳肝硬化模型是一種經典的肝硬化模型，模型具有穩定、死亡率低等特點，廣泛應用于肝硬化實驗研究，是一種良好的研究載體。中醫藥對CCl4造成的肝損傷及肝纖維化具有較好的防治作用［6，7］。李成浩等［8］研究認為黃芪提取物具有明顯的保肝及抗纖維化作用，時磊等［9］觀察芪術顆粒可通過下調實驗大鼠肝臟血管內皮生長因子(VEGF)mRNA的表達來抑制肝纖維化的發生，并通過調控Ang-1、Ang-2/Tie-2 mRNA的表達，阻斷肝竇毛細血管化的形成而減少肝纖維化的產生［10］。本研究藥效表明:復方芪術湯可以顯著改善大鼠肝功能，對CCl4引起的慢性肝纖維化大鼠有很好的降低肝纖維化程度的作用。從以方測證，以效測因的角度也證實了肝硬化“虛損生積”的理論，故肝硬化的治療應該標本同治，在活血化瘀的同時不能忽略顧護正氣。從現代研究水平來看，雖然復方芪術湯的良好的作用療效，但藥物組成眾多，哪一味中藥在起關鍵作用，至今不明確，也是本課題組下一步研究的主要方向。

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［2］陳灝珠，林果為.實用內科學［M］.13版.北京:人民衛生出版社，2009:373-389.

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［8］李成浩，張紅英.黃芪提取物對四氯化碳致大鼠肝纖維化的保護作用［J］.中國實驗方劑學雜志，2011，17(20):217-220.

［9］時磊，劉紹能，李敏，等.芪術顆粒對大鼠肝纖維化形成過程中VEGF表達的影響［J］.世界華人消化雜志，2009，17(36):3675-3678.

［10］劉紹能，時磊，李敏，等.芪術顆粒對肝纖維化模型大鼠Ang-1、Ang-2/Tie-2 的影響［J］.世界華人消化雜志，2009，17(24):2495-2498.

(本文編輯:劉群)

LU Yun-fei，E-mail:luyunfei200@126.com

Objective To investigate the therapeutic effects of Compound Qizhu dedoction on carbon tetrachloride(CCl4)-induced liver fibrosis in rats.Methods 30 Wistar male rats were randomly divided into normal group(10)and CCl4-treated group(20)，CCl4(1 ml/kg)was administratedintraperitoneal to CCl4-treated rats for twice a week for 12 weeks.The normal group injected the same amount of saline.At the first day of the 8 th，the CCl4rats were randomly divided into Compound Qizhu dedoction group(10)and model group(n=10).Both groups continued to receive weekly CCl4treatment for another 4 weeks in addition to daily administration of either saline or Compound Qizhu dedoction，the model group given the same amount of saline.All rats were sacrificed at the 12 weeks.Results Compared with normal rats，alanine aminotransferase(ALT)and aspartate aminotransferase(AST)activity and total bilirubin(TBiL)in the serum was significantly increased in the 12 weeks model rats(P ＜ 0.01)，the albumin(ALB)content decreased remarkably(P ＜ 0.01).Compared with model group，ALB content significantly increased in the Compound Qizhu dedoction rats，and ALT and AST activity was significantly decreased(P ＜0.01)，Compound Qizhu dedoction could decrease TBil content in the serum but there were not significant(P ＞0.05).Compared to 12 weeks CCl4rats，hepatic pathological changes and liver functions were improved significantly in Compound Qizhu dedoction.Conclusions Compound Qizhu decoction exerts significant inhibition on CCl4-induced cirrhosis formation in rats.

Compound Qizhu dedoction;CCl4;Liver fibrosis;Rat

R285.5

A

10.3969/j.issn.1674-1749.2012.05.007

財政部、國家中醫藥管理局2009年中醫藥行業科研專項(200907001-1)

201508上海市公共衛生臨床中心中醫科

陸云飛(1978－)，碩士，主治醫師。研究方向:中醫藥治療感染性疾病。E-mail:luyunfei200@126.com

2012-02-13)