CTLA-4、PTPN22基因多態性與溫州地區漢族人橋本甲狀腺炎的相關性

應俊，邵海剛，潘若望，李佩珍，張洪勤，曾興業

（1.溫州醫學院 生物學實驗教學中心；2.溫州醫學院 檢驗醫學院；3.中國人民解放軍第118醫院外科，浙江 溫州 325000）

橋本甲狀腺炎（Hashimoto’s thyroiditis，HT）是一種器官特異性免疫疾病，屬于自身免疫性甲狀腺病（autoimmune thyroid disease，AITD）的一種，在自身免疫性甲狀腺炎中位居榜首，約占7.3%～20.5%，男女患病比例為1:6～1:10[1]。溫州地區位于我國東南沿海，甲狀腺疾病是當地的常見病之一，其發病率明顯高于內陸地區[2]。HT發病機制至今尚未徹底闡明，目前普遍認為，HT是環境和遺傳共同作用的多基因遺傳性疾病，其中遺傳因素在HT的發病中起著十分重要的作用。為進一步明確病因，我們對HT患者進行了基因檢測，觀察溫州地區漢族人群細胞毒性T淋巴細胞相關抗原-4（CTLA-4）外顯子1第49位點和PTPN基因啟動子-1123位點是否存在多態性以及與HT的相關性，探討HT的遺傳背景。

1 對象和方法

1.1 對象 為溫州地區漢族人，均排除其他自身免疫性疾病史和嚴重的心、肝、腎疾病。①HT組：選自2006年9月-2011年3月就診于溫州醫學院附屬第二醫院、解放軍118醫院內分泌科的HT患者150例，其中男60例，女90例，年齡40～53歲，平均（46.8±5.6）歲。HT的診斷依據為典型的臨床表現結合實驗室檢查，詳見森田陸標準[3]。②健康對照（CN）組：從我院體檢中心按HT患者的年齡分布、性別構成隨機選取健康體檢者120例，其中男48例，女72例，年齡39～55歲，平均（45.7±6.4）歲。兩組患者年齡、性別差異無統計學意義，具有可比性。

1.2 方法 用5% Chelex-100快速提取法[4]提取模板DNA。利用聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態性（PCR-RFLP）技術進行CTLA-4的外顯子1+49位的多態性分析，上游引物：5’-GAAGGATGGTGCTTCACA GAT-3’，下游引物：5’-CTTTGCAGAAGACAGGGATGA-3’，上海捷瑞公司合成。反應條件：94 ℃ 5 min→94 ℃ 40 s，60 ℃ 40 s，72 ℃ 40 s，共35個循環→72 ℃ 7 min→4 ℃保存，擴增產物經6%聚丙烯酰胺凝膠電泳，硝酸銀染色后觀察結果。

利用單一等位基因特異性引物-聚合酶鏈反應（PCR-SASP）技術進行PTPN基因啟動子-1123SNP分析。PTPN22-1123 G > C F1：5’- CATTGAGAGGTTATG CAAGCTC-3’，F2：5’-CATTGAGAGGTTATGCAAGCTG-3’，R：5’-ACCCTGCATATGTAATGCTGGT-3’（上海捷瑞公司合成）。PCR產物全長268 bp，每份標本均使用F1和F2進行擴增，F1與R組成一對引物擴增G等位基因，F2與R組成一對引物擴增C等位基因，根據PCR產物的有無區分基因型。以0.2μg DNA為模板在反應體積為30μL內進行PCR擴增，反應條件：94 ℃ 5 min→94 ℃ 40 s，55 ℃ 40 s，72 ℃ 40 s，共35個 循環→72 ℃ 7 min→4 ℃保存，擴增產物經1%瓊脂糖電泳，溴化乙啶顯色，紫外燈下觀察結果。

1.3 統計學處理方法 數據采用SPSS13.0統計軟件進行處理。以Hardy-Weinberg平衡檢驗確認研究樣本的群體代表性，運用基因計數法計算各組基因頻率及等位基因頻率。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 CTLA-4基因外顯子1+49A>G位點的PCR-RFLP分析 CTLA-4外顯子1的PCR擴增片段長度為652 bp，經Bbv I酶切可得到3種結果：49A/G SNP為基因型AA時產生556 bp和96 bp 2個片段；基因型GG時產生480 bp、96 bp和76 bp 3個片段；基因型AG時產生556 bp、480 bp、96 bp和76 bp 4個片段。由于96 bp和76 bp相對分子質量小，電泳只顯示556 bp 和480 bp（見圖1）。

圖1 CTLA-4外顯子1酶切產物的聚丙烯酰胺凝膠電泳圖（M：DNA分子質量標準；1：PCR產物；2：AA純合型；3：GG純合型；4：AG雜合型）

2.2 PTPN22基因啟動子-1123位點的SASP-PCR分析 PTPN22啟動子擴增片段的長度為268 bp，引物F1針對等位基因G，引物F2針對等位基因C。-1123SNP為GG基因型時F1可擴增出PCR產物；CC基因型時F2可擴增出PCR產物；GC基因型時2對引物均可擴增出PCR產物（見圖2）。

圖2 PTPN基因啟動子擴增產物的瓊脂糖凝膠電泳圖（1、2：CC純合型；3、4：GG純合型；5、6：GC雜合型；7：DNA分子質量標準）

2.3 CTLA-4+49A>G位點（rs231775）多態性在溫州漢族人群HT組和CN組間各基因型及等位基因頻率比較 CTLA-4 49A>G SNP基因型頻率分布均符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律，兩組各基因型和等位基因分布頻率差異有統計學意義（見表1）。

表1 HT組和CN組CTLA-4基因（rs231775）基因型及等位基因分布頻率比較

2.4 PTPN22啟動子-1123G>C位點（rs2488457）多態性在溫州地區漢族人群HT組和CN組間各基因型及等位基因頻率比較 PTPN22-1123G>C SNP基因型頻率分布均符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律，兩組各基因型和等位基因分布頻率差異有統計學意義（見表2）。

表2 HT組和CN組PTPN22基因（rs2488457）基因型和等位基因分布頻率比較

2.5 CTLA-4 +49 A>G位點（rs231775）、PTPN22啟動子-1123G>C位點（rs2488457）基因多態性對HT的相對危險度 CTLA-4基因rs231775位點相對AA基因型而言，GG基因型能顯著增加HT發生的危險性；PTPN22基因rs2488457位點相對于GG基因型而言，GC與GG+GC基因型均能顯著增加HT發生的危險性。等位基因頻率的相對風險分析發現，CTLA-4外顯子1+49位點G等位基因攜帶者患HT的風險是A等位基因的1.616倍（OR=1.616，95%CI：1.142～2.285），PTPN22啟動子-1123位點C等位基因攜帶者患HT的風險是G等位基因的1.459倍（OR=1.459，95%CI：1.034～2.059）。具體見表3。

表4 CTLA-4基因和PTPN22基因的多態性對HT的相對危險度

3 討論

HT是一種器官特異性的自身免疫性疾病，其發病涉及免疫、遺傳、環境等因素，但是確切的機制尚未明了。不同基因和不同的環境因子在不同人群中起著不同的作用，因此確定HT易感性的相關基因成為國內外病因學研究熱點之一。

近年的研究表明：CTLA-4基因多態性與多種自身免疫性疾病的發生風險相關，提示其可能是一新的自身免疫性疾病的遺傳易感基因，已成為目前研究的熱點。許多研究均證明CTLA-4基因外顯子1+49位點存在的多態性與自身免疫性疾病密切相關，但所顯示的結果并不完全一致。Antonio等[5]報道意大利人群中CTLA-4外顯子1+49A/G的多態性與AITD呈顯著相關，Bicek等[6]、Esteghamati等[7]、王巧宏等[8]也均支持49位點G等位基因是AITD的危險因素之一；另外， Namo Cury等[9]探討了巴西人CTLA-4+49A/G的多態性，發現差異無統計學意義；師志云等[10]發現49位點G等位基因與Graves病顯著相關，與HT的發生無關。說明CTLA-4基因多態性存在民族、地區之間的差異。本研究發現HT組CTLA-4+49A/G基因型頻率、等位基因頻率與CN組相比差異有統計學意義，+49位點帶有A/A基因型的個體對HT的發生具有一定的抵抗能力，即那些帶有G/G基因型的個體對HT具有易感性。此外，疾病組+49G等位基因頻率顯著高于對照組（OR=1.616，95%CI：1.142～2.285，P=0.007）。49位點A/G的二態性導致蘇氨酸/丙氨酸的交換可影響前導鏈的構成，使之不能正確引導細胞內CTLA-4分子運輸致使細胞表面CTLA-4分子減少，而引起HT的發生。對HT發病的確切機制以及如何利用CTLA-4的負性調節作用來誘導機體產生免疫耐受而控制疾病的發生等則有待于進一步研究和探討。

蛋白酪氨酸磷酸酶非受體型22（protein tyrosine phosphatase nonreceptor-22，PTPN 22）基因被認為是HLA、CTLA-4之外最為重要的人類自身免疫性疾病的易感基因，定位于1p13，編碼淋巴蛋白酪氨酸磷酸酶（lymphoid protein tyrosine phosphatase，LYP），在T細胞信號通路里起著負調節作用。第一個被識別的PTPN22基因多態性是位于620密碼子1858位C/T，該多態性造成精氨酸到色氨酸突變[11]。最近，日本學者Kawasaki等[12]通過對TID患者PTPN22全基因掃描的研究發現日本人群有5個新的SNP位點，其中-1123G>C突變是另外一個與自身免疫病發病甚為相關的、出現頻率較高的突變位點，結果顯示一個啟動子區域的SNP-1123G>C與快速發病型的1型糖尿病相關，這種關聯在日本人群、朝鮮族人群和高加索人群中均有發現。本研究結果顯示PTPN22-1123G>C（rs2488457）多態性位點存在三種基因型，相對于GG基因型而言，GC與GG+GC基因型均能顯著增加HT發生的危險性；-1123C等位基因攜帶者患HT的風險是G等位基因的1.459倍（OR=1.459，95%CI：1.034～2.059）。可見，PTPN22基因啟動子的-1123G>C SNP與溫州漢族人群HT的發生有相關性，與于志云等[13]報道該位點的SNP與Graves病的發生相關的結果一致。目前關于-1123位點基因多態性如何影響LYP的表達仍不明確，但是分析該位點周圍基因DNA序列，發現-1123G與轉錄因子激活蛋白4（AP-4）的結合位點匹配，而且正好落于AP-4結合共有序列的核心位置上（-1130gcaaGCTGaa-1121）[14]，而-1123C等位基因不能與任何已知的轉錄因子的結合元素相匹配，可能因此影響了Lyp的轉錄效率。但關于PTPN22-1123位點基因多態性在HT的發生、發展過程中產生作用的具體機制仍有待于進一步的研究。

HT是一種多基因遺傳性疾病，基因之間的相互作用可能影響疾病的發生。我們的研究提示CTLA-4基因和PTPN22基因都是HT的易感基因，兩基因均為突變時增加了HT發生的機會。即說明兩基因的變異對疾病的發生起協同作用，對這一協同作用的病理生理基礎的解釋還有待于更深入的研究。

總之，作為一種多基因疾病，HT遺傳易感性可能由多個外顯率不同的基因決定，不同的環境因素以及環境因素與遺傳易感因素之間的相互作用，決定了HT的發生發展。因此，不僅要關注以環境因素為主導作用的致病因素，還應從基因水平進行探討，CTLA-4基因、PTPN22基因多態性類型將可能對HT等自身免疫性疾病的發展、診斷、治療（包括基因治療）提供新的思路。

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