平陽霉素對人臍靜脈內皮細胞株EA.hy926的作用及其機制

劉昭蓉，羅春芬，朱敏，於林軍，范厲龍

（溫州醫學院附屬臺州醫院，浙江 臺州 317000，1.小兒外科；2.公共科研平臺）

平陽霉素（Pingyangmycin，PYM）是一種國產抗腫瘤抗生素。自1991年鄭勤田等[1]首先報道了PYM局部注射治療各種類型的血管瘤210例有效率達100%后，國內相繼有文獻報道PYM用于血管瘤、淋巴管瘤及血管畸形患者的治療，取得了較好的療效[2-3]。PYM用于治療血管瘤等疾病的作用機制研究不多，傳統觀點認為PYM進入人體后產生的氧自由基（OFR）通過干擾DNA復制這一細胞毒作用造成血管內皮細胞損傷，導致血管壁纖維增生、管壁增厚、血栓形成、管腔閉塞[4]。周衛兵等[5]通過細胞學研究發現PYM可通過促凋亡機制抑制血管內皮細胞增殖。筆者從細胞凋亡水平研究PYM對人臍靜脈內皮細胞株EA.hy926的作用及其機制，以期為臨床應用提供一定的理論依據。

1 材料和方法

1.1 實驗材料 EA.hy926細胞株（購自美國ATCC公司）；0.25%胰蛋白酶、M199細胞培養液、胎牛血清（美國Gibco BRL公司產品）；MTS/PMS（北京Promega公司提供）；天冬氨酸半胱氨酸蛋白酶（Caspase）-3、ActiveForm（美國BD Biosciences Pharmingen產品）；人Annexin V-FITC/PI試劑盒（美國Qbiogene產品）；BCA蛋白定量試劑（碧云天生物技術研究所提供）；一抗Caspase-8、Caspase-9、GAPDH及二抗（美國Cell Signaling公司產品）；DAB顯色試劑（美國Sigma公司產品）；注射用PYM粉劑（天津太和制藥有限公司產品）；Novel NIB-100倒置顯微鏡（寧波永新光學股份有限公司產品）；RT6000酶標分析儀（美國Rayto公司產品）；FACS Calibur流式細胞儀（美國Biosciences Cell Quest分析軟件）。

1.2 實驗方法

1.2.1 PYM溶液的配制：將無菌PYM粉劑預先用無菌0.9%的氯化鈉溶液溶解，配制成濃縮原液（4 mg/mL）儲存備用，實驗前用10%血清M199培養液將原液稀釋成實驗所需濃度。

1.2.2 甲基三氯硅烷 （methyltrichlorosilane，MTS）比色實驗：細胞經消化離心后，用培養液配制成5×104/mL濃度的EA.hy926細胞懸液，接種于2塊96孔培養板中。PYM組每個濃度設4個復孔，并設對應的空白孔（不加EA.hy926細胞和PYM）和對照孔（不加PYM），每孔加入細胞懸液200μL，在倒置顯微鏡下觀察到細胞生長至鋪滿孔底后，分別加入20μL不同濃度的PYM培養基溶液，使PYM終濃度為2.5、5、10、20、40、160和320μg/mL。2塊板分別作用24和48 h后，每孔加入MTS 40μL，繼續培養2～4 h。在酶標儀波長490 nm處測定吸光度（OD值），計算細胞生長抑制率（inhibit rate，IR）=[1－（實驗組平均OD值－空白組平均OD值）/（對照組平均OD值－空白組平均OD值）]×100%[6]。半數抑制濃度（IC50）采用Logit法計算，實驗重復3次，求平均值。

1.2.3 細胞形態觀察：每瓶接種2×105個/mL個EA.hy926細胞，培養24 h后，用 10、20、40、80、160μg/mL PYM分別處理24 h，設對照組（0μg/mL PYM），予瑞氏-吉姆薩染色，倒置顯微鏡下觀察細胞形態并拍照。

1.2.4 流式細胞術檢測：EA.hy926細胞以2×105個/mL接種6孔板，PYM分為10、20、40、80和160 μg/mL 5個濃度組，并設對照組（PYM 0μg/mL），每組設3個樣本，作用24 h后，測定：①AnnexinV/FITC/PI：收集經PYM作用后的細胞，每樣本取總數約為1×105的細胞，離心、洗滌后重懸于500μL PBS。取200μL細胞置于預先已加入200μL結合緩沖液的流式細胞儀專用管，加入5μL的AnnexinV/FITC避光孵育15 min，再加入5μL的碘化丙錠溶液（PI）雙染色后，上機檢測。②Caspase-3活性：收集各樣本細胞1×105個，離心、洗滌后重懸于300 μL結合緩沖液，移入流式管，加入FITC-DEVD-FMK 1μL，37 ℃、5% CO2溫箱孵育30 min～1 h，再次離心、洗滌后重懸于500μL結合緩沖液，上機檢測。③羅丹明123染色測定線粒體膜電位：收集各樣本細胞1×105個，離心、洗滌后0.5 mL PBS重懸，加羅丹明123 1.25μL，37 ℃水浴5 min，再次離心、洗滌后0.5 mL PBS重懸，移入流式管，上機檢測。以上實驗均重復4 次，求平均值。

1.2.5 免疫印跡（Western-blot）法檢測：EA.hy926細胞以5×106個接種培養瓶，PYM分為20、40和80μg/mL 3個濃度組，并設對照組（0μg/mL），作用24 h之后，收集各組細胞，洗滌、離心后取沉淀，加入RIPA 100μL及PMSF 1μL混勻，冰上裂解2 h后4 ℃離心30 min，取上清，按照BCA法進行蛋白定量，參照說明書制備標準曲線，然后測定標本管吸光度值，在曲線中找出相應的濃度值，計算得出需要的上樣量，使蛋白上樣量一致。將40μg蛋白上樣于SDS2-PAGE凝膠進行電泳，轉移至PVDF膜，4 ℃下PVDF膜與一抗Caspase-8、Caspase-9（濃度均為1:500）及GAPDH（濃度為1:1000）孵育過夜，洗膜后與HRP連接的二抗（濃度均為1:3000)常溫下孵育2 h，用DAB試劑按1:50配比后顯色。

1.3 統計學處理方法 采用SPSS17.0統計學軟件。計量資料以±s表示，采用方差分析，LSD行兩兩均數間的多重比較。

2 結果

2.1 PYM對EA.hy926細胞的增殖抑制作用 MTS比色檢測結果顯示：2.5～320μg/mL的PYM處理EA.hy926細胞24、48 h后可明顯抑制細胞增殖，見表1。各濃度組間兩兩比較結果發現，在24 h，5μg/mL和10μg/mL、20μg/mL和40μg/mL、160μg/mL和320μg/mL組間差異無統計學意義（均P>0.05），其余各組間差異均有統計學意義（均P<0.05）；在48 h，10μg/mL和20μg/mL、20μg/mL和40μg/mL、160μg/mL和320μg/mL組間差異無統計學意義（均P>0.05），其余各組間差異均有統計學意義（均P<0.05），提示PYM對EA.hy926細胞的生長抑制率與藥物作用濃度有關，在低濃度即呈現明顯的抑制作用，而達到160μg/mL后細胞生長大部分被抑制，抑制率進入平臺期。PYM處理細胞24、48 h后，EA.hy926細胞的IC50分別為14.731μg/mL和6.894μg/mL，提示PYM抑制EA.hy926細胞生長具有濃度時間依賴性。在低濃度組（2.5μg/mL）隨藥物作用時間延長其抑制率明顯下降（P<0.05），推測當PYM作用達到峰值后，未被抑制的細胞繼續增殖，消耗了更多的PYM，使單位細胞數的作用藥物減少，抑制作用隨之減弱。

表1 各濃度PYM作用于EA.hy926細胞的生長抑制率（%）

2.2 PYM對EA.hy926細胞形態學的影響 采用瑞氏-吉姆薩染色，相差顯微鏡下觀察PYM作用前、后EA.hy926細胞形態學變化，結果顯示：在對照組，EA.hy926細胞呈多角形，核居中，絕大部分細胞貼壁生長呈典型的輔路石樣（見圖1）。在10、20μg/mL濃度下，PYM對EA.hy926細胞的作用主要表現為抑制，凋亡的形態學變化不明顯；40、80μg/mL的PYM處理24 h后，EA.hy926細胞呈現典型的凋亡形態學特征，如貼壁生長的細胞數明顯減少，細胞由多角形變為橢圓型或圓形、胞質空泡化、細胞核染色質濃聚、邊緣化，形成環形核或新月形核、核碎裂、凋亡小體形成等（見圖2-3）。當PYM濃度達160 μg/mL，則出現較多壞死細胞，細胞膜崩解，核碎裂，可見較多懸浮的細胞碎片。

2.3 PYM誘導EA.hy926細胞早期凋亡、Caspase-3活化、線粒體膜電位下降的作用 流式細胞儀檢測結果顯示，PYM作用EA.hy926細胞24 h的細胞早期凋亡率、活化Caspase-3表達率及線粒體膜電位下降率在各組間差異均有統計學意義（均P<0.01），隨藥物作用濃度增加而增高，見表2。

圖1 對照組EA.hy926細胞形態（×200）

圖2 40μg/mL PYM處理后EA.hy926細胞形態（×200）

圖3 80μg/mL PYM處理后EA.hy926細胞形態（×200）

表2 PYM對EA.hy926細胞早期凋亡率、活化Caspase-3表達率及線粒體膜電位下降率的影響（±s，%）

表2 PYM對EA.hy926細胞早期凋亡率、活化Caspase-3表達率及線粒體膜電位下降率的影響（±s，%）

組別 早期凋亡率 活化Caspase-3表達率 線粒體膜電位下降率對照組 4.50±0.36 0.39±0.03 7.56±0.49 10μg/mL 14.24±0.27 6.60±0.38 28.30±0.38 20μg/mL 20.83±0.60 11.58±0.54 29.72±0.34 40μg/mL 24.39±0.34 13.24±0.14 34.72±0.34 80μg/mL 27.15±0.28 18.95±0.28 37.21±0.32 160μg/mL28.48±0.47 20.89±0.26 54.24±1.31

2.4 PYM對EA.hy926細胞Caspase-8、Caspase-9蛋白表達的影響 不同濃度（0、20、40、80）μg/mL PYM作用EA.hy926細胞24 h后，Caspase-8、Caspase-9蛋白原始帶隨PYM濃度的增加明顯下調，而激活帶明顯上升，對應的內參GAPDH則無明顯變化，見圖4。

3 討論

圖4 PYM對EA.hy926細胞的Caspase-8、Caspase-9表達的影響

多項研究已發現，PYM作為一種國產抗腫瘤抗生素，可誘導多種腫瘤細胞株發生凋亡[7-10]，亦有文獻報道了PYM可引起脾竇內皮細胞[11]、血管瘤內皮細胞[12]及臍靜脈內皮細胞[4-5]凋亡，顯示了其用于治療血管瘤和血管畸形的獨特優勢。本研究以2.5～320μg/mL的PYM處理EA.hy926細胞，發現其能有效地抑制細胞增殖且呈濃度時間依賴性；形態學觀察發現，PYM作用細胞后出現了典型的凋亡征象，如染色質濃聚、斷裂、胞質空泡化、凋亡小體形成等。

目前認為在細胞凋亡早期，胞漿膜磷脂的不對稱性喪失，使膜內側磷脂酰絲氨酸（PS）暴露于外層，可被對PS特異的AnnexinV探針所標記。PS轉位亦可發生于晚期凋亡細胞和壞死細胞，但早期凋亡細胞胞膜完整，而晚期凋亡和壞死細胞胞膜完整性被破壞，PI可對胞膜完整性被破壞的細胞染色而對胞膜完整細胞拒染，故AnnexinV結合PI行雙染色時，正常活細胞不被染色，凋亡細胞可被AnnexinV標記。本研究通過AnnexinV/PI雙染色法檢測到PYM處理EA.hy926細胞后存在PS由細胞膜內向膜外的轉位,提示，PYM對EA.hy926細胞的生長抑制作用可能是通過凋亡介導的，一定藥物作用時間下的凋亡水平隨藥物濃度的增加而增高。

線粒體膜電位下降是細胞凋亡信號轉導過程的早期事件，為凋亡的特征性改變。有研究[13]顯示，線粒體膜電位的下降或消失反映了線粒體內膜的通透性增加，內膜通透性的增加使僅在線粒體內表達的細胞色素C蛋白釋放到胞漿，繼而發生核的凋亡改變。本實驗通過羅丹明123染色檢測到了PYM作用于EA.hy926細胞24 h線粒體膜電位在各濃度組呈現顯著下降趨勢，提示PYM可影響EA.hy926細胞的線粒體膜電位進而通過激活線粒體途徑誘發細胞凋亡。

業已證實，Caspase家族引發的級聯反應是細胞凋亡過程的中心環節。來自線粒體、細胞表面受體和內質網的凋亡誘導信號促發了Caspase級聯反映，而這一級聯信號通路被歸結為線粒體途徑（內源性途徑）、死亡受體途徑（外源性途徑）和內質網途徑。線粒體途徑受細胞色素C的調節。Bcl-2家族蛋白等凋亡相關蛋白作用于線粒體，使細胞色素C從線粒體釋放到胞漿，胞漿的細胞色素C在dATP存在的條件下結合凋亡激活因子1（Apaf-1）、procaspase-9，形成凋亡小體，并促使procaspase-9發生自我催化，被激活的Caspase-9從復合體上釋放出來作為始動子去激活下游的Caspase-3，從而誘導細胞凋亡[14-15]。死亡受體途徑始于Fas等細胞表面受體，Fas和配體Fasl結合后，吸引胞漿中死亡信號轉錄中的一個連接蛋白FADD，該蛋白又通過與procaspase-8的結合，共同形成死亡誘導信號復合物（DISC)，DISC的行成可誘導procaspase-8自身激活，活化的Caspase-8則進一步激活下游的Caspase-3誘導凋亡[16]。本研究通過流式細胞術及Western-blot法檢測，結果顯示PYM作用于EA.hy926細胞后可引起Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9的活化蛋白水平明顯增加。周衛兵等[5]研究發現，不同濃度PYM作用臍靜脈內皮細胞系24 h后，可上調 Fas蛋白表達，同時下調Bcl-2蛋白表達。因此認為，PYM作用于EA.hy926細胞可能通過線粒體途徑和死亡受體途徑這兩條凋亡通路誘導細胞發生凋亡。該研究為目前臨床上PYM用于血管瘤的治療及促進其進一步的推廣提供了一定的實驗依據，對于我們開發PYM新的劑型，使其治療血管瘤更加微創、更具有靶向性具有重要意義。

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