阿托伐他汀對大鼠缺血心肌TRAIL表達及細胞凋亡的影響

王素云，王海蕓，黃曉燕，王本極，陳必成，潘嘉林，楊德業

（1.溫州醫學院附屬第一醫院 心內科，溫州醫學院 心血管生物和基因研究所，浙江 溫州 325000；2.溫州市第三人民醫院 藥劑科，浙江 溫州 325000；3.溫州醫學院附屬第一醫院 外科實驗室，浙江 溫州 325000）

急性心肌梗死（AMI）是心肌缺血性壞死，屬冠心病的嚴重類型。過去認為壞死是心肌梗死的特征，近年來，越來越多的研究表明凋亡是梗死早期心肌死亡的主要方式[1]。心肌細胞凋亡已經被認為是心血管疾病發生發展的基本機制以及治療心血管疾病的潛在靶點[2]。

腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體（TRAIL）是腫瘤壞死因子超家族（TNFSF）成員[3]。有研究表明在冠心病患者的血清中TRAIL的表達下調[4]，AMI患者循環中CD3+和CD14+細胞表面mTRAIL的表達增加[5]。另有研究表明，TRAIL有抗炎和抗動脈粥樣硬化的活性[6-8]。這些均表明TRAIL可能是心血管疾病的一個重要的調節因子。

本研究通過觀察阿托伐他汀干預缺血心肌TRAIL的表達及心肌細胞凋亡情況，探討阿托伐他汀對心肌細胞凋亡的作用及可能機制。

1 材料和方法

1.1 材料 阿托伐他汀（輝瑞公司贈送），細胞凋亡原位檢測試劑盒（In Situ Cell Death Detection Kit，POD）購自Roche公司，兔抗鼠Bcl-2及Bax多克隆抗體均購自北京中杉金橋，兔抗鼠TRAIL多克隆抗體購自abcam，SP檢測試劑盒購自北京中杉金橋（pv-6001），HX-300動物人工呼吸機（成都泰盟科技有限公司）。

1.2 實驗動物 健康雄性Sprague-Dawley大鼠，60只，體質量250～300 g，購自上海中科院實驗動物中心[動物合格證號：SCXK（滬）2007-0005]。飼養于溫州醫學院實驗動物中心普通級。

1.3 大鼠心肌梗死模型的復制 模型的復制參照文獻[9]。10%的水合氯醛（350 mg/kg，腹腔注射）麻醉大鼠，以小動物呼吸機機械通氣，頻率為70次/min，呼吸比3:2，潮氣量5～8 mL。于3或4肋間剪一2 cm橫切口，鈍性分離胸大肌和前鋸肌，剪開肋間肌及胸膜暴露心臟，采用左前降支結扎的方法建立大鼠心肌梗死模型，以II導聯心電圖上見ST段明顯抬高，同時梗死區心肌顏色變白，室壁運動明顯減弱為手術成功的標志。

1.4 分組 術后24 h存活大鼠隨機分為心梗組和阿托伐他汀組。阿托伐他汀組予以阿托伐他汀10 mg·kg-1·d-1溶于2 mL 0.9%氯化鈉溶液中，灌胃給藥治療2周。假手術組開胸后只穿線不結扎。兩組均予等量0.9%氯化鈉溶液灌胃。

1.5 血脂水平測定 各組大鼠手術處理前在乙醚麻醉下眼眶采血約1 mL，采血前禁食12 h以上。給藥2周后，禁食12 h以上，10%水合氯醛腹腔麻醉，開胸心臟采血約2 mL。所采血液靜置30 min，3000 r/min離心20 min，分離血清，用全自動生化分析儀檢測血清中總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度膽固醇（HDL-C）和低密度膽固醇（LDL-C）含量。

1.6 心肌組織病理學分析 各實驗組心肌組織經甲醛固定，常規石蠟包埋，5μm 切片，常規HE染色后，光鏡下觀察。心梗面積=左室梗死區周徑/[（左室心內膜周徑+左室心外膜周徑）/2] ×100%。

1.7 TUNEL分析 按常規病理組織學方法制備心肌石蠟標本。改良TUNEL方法[10]以Dnase I處理的組織作陽性對照，同時設立陰性對照。TUNEL陽性反應為核呈棕褐色或棕黃色顆粒，被判定為凋亡細胞。400倍顯微鏡下在非缺血區心肌隨機取10個視野，計數凋亡細胞數和細胞總數。凋亡指數（%）=凋亡細胞數/細胞總數×100%。

1.8 Bcl-2、Bax、TRAIL的免疫組織化學檢測 采用SP兩步法: 滴加一抗Bcl-2 1:100，Bax 1:100，TRAIL 1:20 4 ℃過夜。以山羊抗兔二抗（北京中杉）孵育30 min。DAB顯色。蘇木素復染。以PBS代替一抗為陰性對照。結果評價：Bcl-2和Bax陽性細胞均為胞漿著色，呈棕黃色顆粒；TRAIL陽性細胞為胞漿和胞膜著色，呈淺黃、棕黃色。400倍顯微鏡下在非缺血區心肌選取5個不重疊的陽性視野，用Image J圖像分析儀進行分析，測定細胞陽性染色的平均光密度（OD值）與陽性細胞百分比，計算蛋白陽性表達指數（PEI）。PEI=OD值×陽性細胞百分比×100。同時計算Bcl-2與Bax的比值。TRAIL用平均光密度表示其相對表達量。

3.2 利用CaCO3透明圈法可以篩選出產酸菌，然后再結合革蘭氏染色以及代謝產物分析可以初步確定分離所得菌株為乳酸菌，但要確定其種屬還要進行進一步的鑒定。

1.9 熒光實時定量RT-PCR 各組大鼠3只，心臟組織總RNA由TRIzol法提取。經紫外吸收測定和變性瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA質量后，按RevertAidTM First Strand cDNA Synthe-sis Kit RT試劑盒說明書逆轉錄合成cDNA后，用TRAIL、Bax、Bcl-2實時定量RT-PCR引物（由上海英駿生物技術有限公司合成）進行熒光定量PCR檢測，GAPDH作為內部參照。TRAIL引物序列為上游：5’-CCGATCCCATACTGCTG ATGA-3’，下游：5’-TTTGAGCTCGAACAGCCCC-3’；Bax上游：5’-AGCGGCTGCTTGTCTGGAT-3’，下游：5’- TG AGGACTCCAGCCACAAAGA-3’；Bcl-2上游：5’- TTCTCTC GTCGCTACCGTCG-3’，下游：5’- CCCTGAAGAGTTCCTCCA CCA-3’；GAPDH上游：5’-TCCTGCACCACCAACTGCTTAG-3’，下游：5’-AGTGGCAGTGATGGCATGGACT-3’。用ABI 7500 FAST型熒光定量PCR 儀檢測，實驗重復3次。通過比較ΔΔCt的方法進行TRAIL、Bax、Bcl-2表達的定量分析，相對表達量用2－ΔΔCt表示。Ct為每個反應管內的熒光信號到達設定的閾值時所經歷的循環數，ΔCt為TRAIL、Bax、Bcl-2 Ct值與內參GAPDH Ct值之差，ΔΔCt為TRAIL、Bax、Bcl-2 ΔCt與假手術組ΔCt均值的差值。

1.10 統計學處理方法 應用SPSS 17.0統計軟件，所有數據均采用±s描述，多組間比較應用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD法。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 HE染色 光鏡下觀察，假手術組心肌纖維排列整齊，未見變性及壞死；模型組大鼠心肌纖維排列紊亂，心肌細胞溶解性壞死，間質增生，并有炎性細胞浸潤（見圖1）。除假手術組外，心肌梗死面積<30%的予以剔除，結果，假手術組大鼠6只，心梗組和阿托伐他汀組各8只被納入統計。

圖1 大鼠心肌HE染色（×10）

2.2 各組大鼠TC、TG、HDL-C、LDL-C水平的變化各組大鼠治療后與治療前TC、TG、HDL-C、LDL-C水平相比，無明顯變化（P>0.05），表明阿托伐他汀在心肌梗死中發揮的治療作用與其降脂作用無明顯關系（見表1）。

2.3 TUNEL法檢測心肌細胞凋亡 假手術組中偶見凋亡心肌細胞，心梗組可見大量胞核呈深淺不一棕褐色的凋亡心肌細胞。心肌細胞凋亡指數，與假手術組相比，心梗組顯著升高（P<0.01）；與心梗組相比，阿托伐他汀組顯著下降（P<0.01）。阿托伐他汀干預心肌缺血大鼠能明顯減少其心肌細胞的凋亡（見表2、圖2）。

圖2 TUNEL法檢測各組大鼠心肌細胞凋亡（×400）

2.4 Bcl-2、Bax、TRAIL蛋白表達 Bcl-2各組之間的相對表達量，阿托伐他汀組>心梗組>假手術組。各組組間比較，與假手術組相比，心梗組明顯升高（P<0.05），阿托伐他汀組顯著升高（P<0.01），與心梗組比，阿托伐他汀組明顯升高（P<0.05），表明阿托伐他汀干預心肌缺血大鼠能升高Bcl-2的表達（見表2）。

Bax在各組間均有表達，但差異無統計學意義，見表2。

與假手術組和心梗組相比，阿托伐他汀組Bcl-2與Bax的比值明顯升高（P<0.05），而心梗組與假手術組相比差異無統計學意義（P>0.05），表明阿托伐他汀干預心肌缺血大鼠能升高Bcl-2與Bax的比值（見表2）。

與假手術組相比，心梗組TRAIL表達顯著下降（P<0.01），阿托伐他汀組與心梗組相比表達顯著升高（P<0.01），表明阿托伐他汀干預心肌缺血大鼠能上調TRAIL表達（見表2）。

2.5 定量RT-PCR結果 與假手術組相比，心梗組TRAIL mRNA表達顯著下降（P<0.01），與心梗組相比，阿托伐他汀組TRAIL mRNA表達顯著升高（P<0.01），表明阿托伐他汀干預心肌缺血大鼠能上調TRAIL mRNA表達。假手術組與心梗組Bcl-2 mRNA表達無明顯差異，與心梗組比較，阿托伐他汀組Bcl-2 mRNA表達升高（P<0.05），表明阿托伐他汀干預心肌缺血大鼠能上調Bcl-2 mRNA表達。

與假手術組相比，心梗組及阿托伐他汀組Bax mRNA表達均升高，與心梗組比較，阿托伐他汀組下降（P<0.05），表明阿托伐他汀干預心肌缺血大鼠能下調Bax mRNA表達。與假手術組相比，心梗組Bcl-2/Bax顯著下降（P<0.01），與心梗組比較，阿托伐他汀組Bcl-2/Bax升高（P<0.05），表明阿托伐他汀干預心肌缺血大鼠能上調Bcl-2/Bax的值（見表 3）。

3 討論

阿托伐他汀屬他汀類降脂藥物，是一種3-羧-3-甲基戊二酰輔酶A（3-hydroxy-3-methylglutaryl CoA，HMG-COA）抑制劑。他汀類藥物能顯著降低TC、TG的合成。最近研究發現他汀類藥物能發揮獨立于降脂外的效應。他汀類藥物能恢復損傷的內皮細胞的功能，恢復血流[11-12]。在急性冠脈綜合征患者中，他汀類藥物具有穩定粥樣斑塊、抗炎及減少心肌梗死和中風概率的作用[13]。研究表明，他汀類藥物在經皮冠脈介入術、冠脈搭橋術中起到保護心肌，減小心肌梗死面積的作用[14]。Tanaka等[15]觀察到阿托伐他汀能阻斷PKC抑制劑誘導培養的大鼠心肌細胞凋亡。Ogata等[16]比較氟伐他汀與普伐他汀對培養鼠心肌細胞增殖的影響，發現氟伐他汀呈時間及劑量依賴性誘導心肌細胞凋亡，普伐他汀則無此作用。本實驗發現，10 mg·kg-1·d-1阿托伐他汀能顯著減少心肌梗死邊緣區的心肌細胞凋亡，其機制可能與上調Bcl-2，下調Bax及最終上調Bcl-2/Bax的比值有關。

表1 各組大鼠血脂水平比較（n=5，±s，mmol/L）

表1 各組大鼠血脂水平比較（n=5，±s，mmol/L）

組別假手術組心梗組阿托伐他汀組TC 1.91±0.18 1.63±0.10 1.98±0.26術前術后2周TG 0.42±0.26 0.47±0.26 0.73±0.24 HDL-C 0.67±0.06 0.57±0.03 0.73±0.14 LDL-C 0.38±0.10 0.19±0.02 0.31±0.05 TC 1.46±0.17 1.17±0.09 1.27±0.19 TG 0.41±0.34 0.21±0.10 0.16±0.06 HDL-C 0.55±0.03 0.45±0.02 0.42±0.10 LDL-C 0.24±0.053 0.29±0.05 0.29±0.06

表2 各組Bcl-2、Bax、TRAIL蛋白表達及凋亡指數比較（±s）

表2 各組Bcl-2、Bax、TRAIL蛋白表達及凋亡指數比較（±s）

與假手組比：aP<0.05，bP<0.01；與心梗組比：cP<0.05，dP<0.01

TRAIL（n=5）3.08+0.56 1.47+0.38b 3.85+0.31d組別假手術組心梗組阿托伐他汀組Bcl-2（n=6）11.50±8.80 50.50±13.74a 89.31±18.87bc Bax（n=6）23.12±11.53 91.43±46.76 57.78±44.86 Bcl-2/Bax 0.43±0.28 0.59±0.15 2.03±0.95ac凋亡指數（n=5）6.33±5.15 64.15±1.87b 26.33±8.18d

表3 TRAIL、Bcl-2、Bax基因定量RT-PCR結果（n=6±s）

表3 TRAIL、Bcl-2、Bax基因定量RT-PCR結果（n=6±s）

與假手術組比：aP<0.05，bP<0.01；與心梗組比：cP<0.05，dP<0.01

Bcl-2/Bax 0.63±0.37 0.16±0.06b 0.47±0.19c組別假手術組心梗組阿托伐他汀組TRAIL 1.03±0.28 0.36±0.23b 0.80±0.34d Bcl-2 0.23±0.12 0.15±0.03 0.33±0.11c Bax 0.38±0.05 1.01±0.45b 0.72±0.08ac

TRAIL屬II型跨膜蛋白，目前已發現5種TRAIL受體，包括兩種死亡受體DR4、DR5，兩種誘騙受體DcR1、DcR2和一種可溶型受體OPG，均屬TNFSF成員。TRAIL與受體DR4、DR5結合可以通過依賴線粒體和非依賴線粒體兩條途徑發揮促凋亡的作用，而與DcR1、DcR2結合可以保護細胞不發生凋亡。

文獻報道，正常心臟組織中發現有TRAIL及其受體的表達，其中DR5的表達水平很高[17]。Nakajima等[18]用免疫組化法發現在AMI患者的病理組織中，變性的心肌細胞有DR4和DR5的表達，提示TRAIL及其受體可能參與某些病理狀態下的細胞凋亡。但Secchiero等[19]認為，在心血管系統，TRAIL只在特定的情況下誘導血管內皮細胞的凋亡，比如抑制Akt通路。有研究發現，在冠心病患者的血清中TRAIL的表達下調[4]；另有研究發現，AMI后早期血清TRAIL表達顯著下降，隨后逐漸升高，6～12個月恢復到接近健康水平，早期心肌梗死血清TRAIL的表達下降水平與心血管事件的發生密切相關，與負性預測指標如CK、CK-MB、BNP呈負相關，因此，循環中的TRAIL在冠心病患者中可能起到保護作用[17]。最近的研究也證實，TRAIL及其受體（DR4和DR5）能促進多種細胞包括淋巴細胞、內皮細胞、血管平滑肌細胞、成纖維細胞的存活和增殖[20-22]。現在被廣泛接受的觀點是，TRAIL與受體DR4、DR5的結合能激活轉錄因子NF-κB，繼而激活抗凋亡基因包括CIAP1、CIAP2、XIAP、TRAF1、TRAF2、c-FLIP和Bcl-XL。TRAIL與DR4和DR5結合也可以激活參與細胞存活過程的ERK1/2、MAPK、JNK和Akt[23]。我們的研究發現，就蛋白質水平及基因水平，急性心肌梗死后心肌TRAIL表達較假手術組均明顯下降，阿托伐他汀組缺血心肌TRAIL表達明顯升高，由此，我們推測，阿托伐他汀干預缺血心肌TRAIL表達上調可能參與了心血管的保護作用，這種作用可能與TRAIL的抗凋亡作用有關，而這種抗凋亡作用一部分可能與Bcl-2的高表達、抑制線粒體凋亡通路有關。

TRAIL基因在腫瘤的研究中較多，而在心血管領域的研究有限，我們的發現，結合前人的研究發現，TRAIL除了促進凋亡的作用，同時也有抗凋亡的作用，如何平衡其在兩者中的作用，以發揮對疾病的治療作用，具有一定的研究價值。阿托伐他汀是治療心肌缺血的常用藥物，其除了降脂作用外，還有多種作用，我們發現其改變了心肌TRAIL因子的表達，從而通過某種機制參與了抗凋亡作用。

[1] 中華內科雜志編委會心血管病學編寫組.我國心血管疾病十年回顧[J].中華內科雜志,1999,38(9):599-603.

[2] Yue TL,Ohlstein EH,Ruffolo RRJr.Apoptosis:a potential target for discovering novel therapies for cardiovascular disease[J].Curr Opin Chem Biol,1999,3(4):474-480.

[3] Wiley SR,Schooley K,Smolak PJ,et al.Identification and characterization of a new member of the TNF family that induces apoptosis[J].Immunity,1995,3(6):673-682.

[4] Schoppet M,Sattler AM,Schaefer JR,et al.Osteoprotegerin(OPG) and tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL) levels in atherosclerosis[J]. Atherosclerosis,2006,184(2):446-447.

[5] Liao X,Wang X,Gu Y,et al.Involvement of death receptor signaling in mechanical stretch-induced cardiomyocyte apoptosis[J].Life Sci,2005,77(2):160-174.

[6] Zauli G,PandolfiA, Gonelli A, et al. Tumor necrosis factorrelated apoptosis inducing ligand (TRAIL) sequentially upregulates nitric oxide and prostanoid production in primary human endothelial cells[J].Circ Res,2003,92(7):732-740.

[7] Secchiero P,Corallini F,di Iasio MG,et al.TRAIL counteracts the proadhesive activity of inflammatory cytokines in endothelial cells by down-modulating CCL8 and CXCL10 chemokine expression and release[J].Blood,2005,105(9):3413-3419.

[8] Secchiero P,Candido R,Corallini F,et al.Systemic TRAIL delivery shows anti-atherosclerotic activity in apoE-null diabetic mice[J].Circulation,2006,114(14):1522-1530.

[9] 劉開宇,田海,孫露,等.標準化大鼠心肌梗死模型的制作[J].哈爾濱醫科大學學報,2007,41(6):531-534.

[10] 朱漢華,李浪,汪熠,等.TUNEL檢測心肌細胞凋亡的影響因素探討[J].廣西醫科大學學報, 2009,26 (1):24-26.

[11]Chen L,Haught WH,Yang B,et al.Preservation of endogenous antioxidant activity and inhibition of lipid peroxidation as common mechanisms of antiatherosclerotic effects of vitamin E, lovastatin and amlodipine[J]. J Am Coll Cardiol,1997,30(2):569-575.

[12]Brandes RP,Behra A,Lebherz C,et al.Lovastatin maintains nitric oxide--but not EDHF-mediated endothelium-dependent relaxation in the hypercholesterolemic rabbit carotid artery[J]. Atherosclerosis,1999,142(1):97-104.

[13]Bates K,Ruggeroli CE,Goldman S,et al.Simvastatin restores endothelial NO-mediated vasorelaxation in large arteries after myocardial infarction[J].Am J Physiol Heart Circ Physiol,2002,283(2):H768-H775.

[14] Atar S,Ye Y,Lin Y,et al.Atorvastatin-induced cardioprotection is mediated by increasing inducible nitric oxide synthase and consequent S-nitrosylation of cyclooxygenase-2[J].Am J Physiol Heart Circ Physiol, 2006,290(5):H1960-H1968.

[15]Tanaka K,Honda M,Takabatake T. Anti-apoptotic effect of atorvastatin, a3-Hydroxyl-3-methylglutaryl coenzyme a reductase inhibitor, on cardiac myocytes through protein kinase C activation[J] .Clin Exp Pharmacol Physiol,2004,31(5-6):360-364.

[16] Ogata Y,Takahashi M,Takeuchi K,et al. Fluvastatin induces apoptosis in rat neonatal cardiac myocytes:a possible mechanism of statin attenuated cardiac hypertrophy[J].J Cardiovasc Pharmacol,2002,40(6):907-915.

[17] 宋朝君,劉雪松,陳立華,等.TRAIL及其受體在正常心臟組織的免疫組織化學定位[J].心臟雜志, 2003,15(6):490-492.

[18]Nakajima H,Yanase N,Oshima K,et al.Enhanced expression of the apoptosis inducing ligand TRAIL in mononuclear cells after myocardial infarction[J].Jpn Heart J,2003,44(6):833-844.

[19] Secchiero P,Corallini F,Ceconi C,et al. Potential prognostic significance of decreased serum levels of TRAIL after acute myocardial infarction[J].PLoS one, 2009,4(2):e4442.[20]Secchiero P, Gonelli A,Carnevale E,et al.TRAIL promotes the survival and proliferation of primary human vascular endothelial cells by activating the Akt and ERK pathways[J].Circulation,2003,107(17):2250-2256.

[21]Secchiero P,Zerbinati C,Rimondi E,et al. TRAIL promotes the survival, migration and proliferation of vascular smooth muscle cells[J].Cell Mol Life Sci, 2004,61(15):1965-1974.

[22]Morel J, Audo R, Hahne M, et al. Tumor necrosis factor related apoptosis-inducing ligand (TRAIL) induces rheumatoid arthritis synovial fibroblast proliferation through mitogen-activated protein kinases and phosphatidylinositol3-kinase/Akt[J].J Biol Chem,2005,280(16):15709-15718.

[23]Kavurma MM, Bennett MR. Expression, regulation and function of trail in atherosclerosis[J]. Biochem pharmacol,2008,75(7):1441-1450.