新疆傳統發酵酸乳中屎腸球菌Enterococcus Faecom的高密度培養

胡敏，閆輝，楊潔

（新疆大學生命科學與技術學院，烏魯木齊830046）

新疆傳統發酵酸乳中屎腸球菌Enterococcus Faecom的高密度培養

胡敏，閆輝，楊潔

（新疆大學生命科學與技術學院，烏魯木齊830046）

對本實驗室分離的屎腸球菌（以下編號HT-f）進行高密度培養條件及培養基的優化。研究了該菌生長繁殖的環境條件和培養基組成對其生長的影響。優化后確定了該菌最適生長條件。該菌在培養條件優化前最高生物量為6.83 g/L，而條件優化后的生物量值達到16.6 g/L。對該菌高密度發酵培養基進行了優化，經正交實驗處理，得出最佳培養基配方。結合優化的培養條件，最后測得的生物量值則高達35.4 g/L。該研究旨在為后期的工業化生產優質高效的乳酸菌發酵劑奠定基礎。

HT-f乳酸菌；高密度發酵；生長曲線；正交實驗

0 引 言

乳酸菌廣泛存在于發酵乳制品中，大量優良的乳酸菌有待開發和利用[1]。本實驗室利用從25個酸乳及奶酪樣品中篩選出79株乳酸菌，優選了一株發酵特性好，ACE抑制率較高（52.9%），降膽固醇能力較強（48.9%）的乳酸菌，經分子生物學鑒定為屎腸球菌（以下編號為HT-f），而屎腸球菌是腸系菌群平衡的關鍵菌株[2]，具有較好的抑菌效果和降膽固醇等益生功能。

高密度培養[3]沒有確切的定義，指應用一定的培養技術和裝置提高特定產物的比生產率[4]。國外對乳酸菌細胞循環法和透析法做了很多研究[5]。高密度培養技術應用較少[6]，高密度培養條件中，培養基與產量系數和比生長速率之間存在直接關系，高濃度的培養基成分對高密度培養也有一定的抑制作用[7]。

1 材料與方法

1.1 菌種與培養基

菌種（HT-f）本實驗室篩選自新疆和田地區的酸乳樣品。

MRS培養基，PY培養基參考文獻[8]中的方法，PYG培養基（在PY培養基中加入0.1%的葡萄糖即可）。

鹽 溶 液： 無水CaCl2為0.02%，MgSO4·7H2O為0.048%,KH2PO4為0.1%,K2HPO4為0.1%,NaHCO3為1%,NaCl為0.2%（均為質量分數）。

1.2 儀器與設備

GXZ型智能光照培養箱，Spectrumlab 24可見分光光度計，SHPH-6型 pH控制-補料搖床 （多模式補料），潔凈工作臺。

1.3 方法

1.3.1 HT-f菌生長曲線、產酸曲線的測定

將實驗室保藏菌種活化、純化、擴培，進行生理生化特性的測定[7]，在兩個pH-控制補料搖床專用的500 mL三角瓶中，分別裝入200 mLMRS液體培養基，其中一個接入5%的乳酸菌，另一個作為空白對照，37℃培養30 h，每2 h測OD600值。以培養時間為橫坐標，OD600值、pH值為縱坐標，繪制生物量變化曲線，產酸曲線[9]。

HT-f菌株發酵OD值與生物量關系：分別取10 mLMRS液體培養基于30支試管中，接入5%的HT-f菌株37℃培養24 h，每2 h測其OD600值、離心測定其沉淀質量即生物量，并以OD600值為縱坐標，生物量為橫坐標作圖。

由圖1可知，在OD600值為0.2～0.8期間，生物量與OD600值呈現線性關系：

式中：Y為為OD600值；X為為生物量值。

1.3.2 培養條件的優化

（1）pH值對HT-f菌高密度發酵的影響。在500 mL三角瓶中分別裝入200 mL初始pH值為5.6，5.9，6.2，6.5的MRS液體培養基，接種5%的HT-f乳酸菌菌株，于pH-控制補料搖床37℃發酵120 r/min培養24 h，每4 h測其OD600值，由此確定最佳pH值。

（2）溫度對HT-f菌高密度發酵的影響。在500 mL三角瓶中，分別裝入體積200 mL的MRS液體培養基，以5%的接種量接種后分別于25，28，31，34，37，40 ℃中培養24 h，每4 h測其OD600值，以此確定最佳發酵溫度[10]。

（3）灌裝量HT-f菌高密度發酵的影響[11]。 在500 mL三角瓶中分別取30%，40%，50%，60%，70%的灌裝量加入MRS液體培養基 （即加入MRS液體培養基150，200，250，300，350 mL），以5%的接種量接種，在最佳溫度、最佳pH值進行發酵。用質量分數10%為Na2CO3溶液調節初始pH值來保持發酵期間pH值的穩定。每4 h測其OD600值，以此確定最佳灌裝量。

（4）接種量對HT-f菌高密度發酵的影響。在500 mL三角瓶中，加入最佳灌裝量的MRS液體培養基于，分別以3%，4%，5%，6%，7%的接種量接種，最佳溫度、最佳pH值為初始值，進行發酵，用質量分數10%的Na2CO3溶液調節初始pH值保持發酵期間pH值的穩定。每4h測其OD600值，以確定最佳接種量。

（5）最優培養環境培養生長曲線、產酸曲線的測定。在500 mL三角瓶中，加入最佳灌裝量的MRS液體培養基，接種后于最佳溫度、pH值條件下培養發酵，用質量分數10%的Na2CO3溶液調節初始pH值來保持發酵期間pH值的穩定，每2 h測定OD600值，以培養時間為橫坐標，相應的OD600值、pH值為縱坐標，繪制生長量變化曲線，產酸曲線。

1.3.3 培養基的優化[12]

（1）培養基碳源對HT-f菌高密度培養的影響。在500 mL三角瓶中，加入最佳灌裝量的不含碳源的MRS液體培養基。分別加入質量分數2%的不同碳源（葡萄糖、蔗糖、乳糖、麥芽糖）于瓶中。以最佳接種量接種，在最佳溫度、pH值條件下培養，用質量分數10%的Na2CO3溶液調節初始pH值來保持發酵期間pH值的穩定，16 h后測定OD600值，以確定最佳碳源。

（2）培養基氮源對HT-f菌高密度培養的影響。在500 mL三角瓶中，加入最佳灌裝量的不含氮源的MRS液體培養基。分別加入1%的不同氮源（如：牛肉膏、蛋白胨、胰蛋白胨、大豆蛋白胨、酪蛋白胨）。最佳接種量接種，在最佳溫度、最佳pH值下培養，用10%Na2CO3溶液調節初始pH值來保持發酵期間pH值的穩定，16 h后測定OD600值，以確定最佳氮源。

（3）培養基生長因子對HT-f菌高密度培養的影響。在500 mL三角瓶中，加入最佳灌裝量的液體培養基。分別加入乳清粉、維生素、玉米漿干粉。最佳接種量接種，在最佳溫度、最佳pH值條件下培養，用質量分數10%的Na2CO3溶液調節初始pH值來保持發酵期間pH值穩定，16 h后測定OD600值，以確定最佳生長因子。

（4）培養基多因素正交實驗。通過以上的單因子試驗確定最佳碳源、氮源和生長因子采用正交實驗設計確定培養基。確定其因素水平如表1所示。

表1 正交因素水平表

2 結果與分析

2.1 HT-f菌生長曲線、產酸曲線的測定

2.2 培養環境的優化

2.2.1 pH值對HT-f菌株高密度發酵的影響

由圖3可以看出，HT-f菌的最優pH值為6.2。在發酵15 h時的生物量達到最大值。做對比得出圖3（c）(pH值為6.2)菌體濃度最高，所以HT-f菌的最佳發酵pH值為6.2。從空白對照圖3(e)可知，其生物量保持在0.07～0.1之間，說明在本次發酵培養期間沒有雜菌污染。

2.2.2 溫度對HT-f菌高密度發酵的影響

由圖4可以看出，HT-f菌的最優生長溫度為34℃。隨著發酵時間的延長，上述各溫度下所測得的生物量都在逐步增加，其中在34℃下發酵生物量最大，生物量為5.75 g/L。空白對照生物量一直保持在0.07～0.1 g/L之間，則說明本次發酵沒有雜菌污染。

2.2.3 灌裝量HT-f菌高密度發酵的影響

由圖5可以看出，HT-f菌發酵的最佳灌裝量為50%。菌株的生物量都隨著發酵時間的延長而增長，其中50%的灌裝量在12 h的生物量最高為18 g/L。空白對照的生物量保持在0.06～0.18 g/L之間，則說明沒有雜菌污染。

2.2.4 接種量對HT-f菌高密度發酵的影響

由圖6可以看出，HT-f菌高密度發酵條件最佳的接種量為4%。生物量隨著發酵時間的延長而增加，按4%的接種量接種培養，得到了比按其他百分比接種培養都大的生物量15.85 g/L。空白對照的生物量維持在0.07～0.1 g/L之間，則說明本次發酵沒有雜菌污染。

2.2.5 最優培養環境培養生長曲線、產酸曲線的測定

煮瓜子不像炒瓜子那樣吃多了會上火。外面賣的煮瓜子會有食品添加劑，那么就自己煮，然而自己煮如何烘干呢？這時候暖氣就派上用場了。把葵花子加水、花椒、大料和鹽煮熟之后，放暖氣片上烘干即可。如果您住的是老式紅磚樓，那就更好了，樓里配置的鑄鐵暖氣比一般暖氣燒得旺，瓜子更容易脫水，保持脆性。

由圖7可以看出，10 h時對數期結束，開始進入穩定期，最高生物量達到15.40 g/L，比優化之前的生物量高出一倍多。由空白對照表知其生物量維持在0.06～0.16 g/L之間，說明本次發酵沒有雜菌污染。

2.3 培養基的優化

2.3.1 培養基碳源對HT-f乳酸菌高密度培養的影響由圖8可以看出，HT-f菌高密度發酵培養基的最佳碳源為麥芽糖。以麥芽糖做碳源時的生物量最高，葡萄糖、蔗糖其次，乳糖最少。空白對照組生物量相對極少，說明沒有雜菌污染。

2.3.2 培養基氮源的優化

由圖9可以看出，HT-f菌高密度發酵培養基的最佳氮源為牛肉膏。以牛肉膏做氮源時的生物量最高，蛋白胨、胰蛋白胨、大豆蛋白胨、酪蛋白胨次之。空白對照組生物量相對最少，培養基成分中起生長因子作用的酵母浸粉、檸檬酸二胺可以作為氮源利用，因此生物量達到7.74 g/L。

2.3.3 培養基生長因子的優化

由圖10可以看出,乳酸菌高密度發酵培養基的最佳生長因子是玉米漿干粉。以玉米漿干粉作生長因子時生物量達到最高，乳清粉次之，維生素C最少。空白對照組生物量相對較少，因為培養基成分中起氮源作用的牛肉膏含有部分生長因子，所以生物量也達到了5.26 g/L。

2.3.4 培養基多因素正交實驗結果

采用正交實驗設計優化碳源（麥芽糖）、氮源（牛肉膏）、生長因子（玉米漿干粉）用量（分別取1.5%，2%，2.5%），實驗結果如表4所示。

由表4可以看出，A(碳源麥芽糖)、C(氮源牛肉膏)、D(生長因子玉米漿干粉)的極差分別為5.266、5.640、4.626，有RC＞RA＞RD，則其影響因素主次為CAD。由圖10的趨勢圖可知，最優方案為A2C2D2，但由于表中沒有按A2C2D2的配比，需要做補充實驗加以證實。按A2C2D2配方其他條件不變，進行補充實驗，最終結果測得生物量為35.54 g/L，說明該配比確實為培養基的最適發酵配比。即最適培養基成分比為麥芽糖2%，牛肉膏2%，玉米漿干粉 2%。

2.4 驗證實驗

將本研究確定的最佳高密度培養條件和最佳培養基配方結合運用在HT-f菌的高密度培養中，得出高密度培養的結果。

表4 正交實驗結果

3 結 論

本研究通過對采自新疆傳統發酵酸乳樣品中篩選出的乳酸菌。將篩選出的HT-f進行活化、純化、擴培，通過生理生化實驗檢測，分子生物學鑒定為屎腸球菌。再進行一般發酵測得生長曲線、產酸曲線，確定該菌乳酸菌在培養發酵過程中產酸程度，得到最高生物量為6.83 g/L。在培養環境的優化過程中，得出HT-f乳酸菌的最適溫度為34℃，最適pH值為6.2、最適灌裝量為50%、最適接種量為4%。利用實驗得出的最優培養條件進行生長曲線和酸度曲線測繪，得出最高生物量16.6 g/L，是之前生物量的2.4倍。在前期高密度培養條件和培養基優化的基礎上，通過正交試驗，確定出HT-f擴大發酵的培養基最佳C源、N源，生長因子配方為麥芽糖 2%，牛肉膏2%，玉米漿干粉2%（均為質量分數）。最終，利用優化后的最佳培養條件和最佳培養基進行高密度發酵，測得最高生物量為35.54 g/L，是一般發酵的5.2倍，由此達到了高密度培養預期目的，使得今后在將該菌應用于工業化生產具有低成本高產量的優勢。

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Optimization of cultural conditions of Enterococcus Faecom on high density culture

HU Min,YAN Hui,YANG Jie
（Xinjiang University，College of Life Science and Technology，Urumqi 830046，China）

In order to optimize the culture mediums and the high-dense cultural condition of the HT-f Lactobacillus in this laboratory,the effects of environmental conditionsand medium composition on HT-f lactobacillus'growth have been studied.Under the condition,the highest biomass of the HT-f lactobacillus strain reached 16.6 g/L while the highest biomass under normal cultural conditions was 6.83 g/L.In addition,the experiment also optimized the high-dense culture mediums.According to the orthogonal experiment,the highest biomass finally got to 35.4 g/L.This research was aimed at laying the foundation for the industrious production of high-qualified Lactobacillus in the advanced stage.

HT-f lactobacillus；high density culture；Growth curve；Orthogonal test

Q939.11+7；Q93-335

A

1001-2230（2012）04-0012-06

2011-12-05

胡敏（1985-），女，碩士，研究方向為乳品微生物。

楊潔