反相離子對(duì)色譜法測(cè)定奶粉中核苷酸質(zhì)量濃度

許彬，張仕華

（廣東雅士利集團(tuán)有限公司技術(shù)中心，廣東 潮州515638）

反相離子對(duì)色譜法測(cè)定奶粉中核苷酸質(zhì)量濃度

許彬，張仕華

（廣東雅士利集團(tuán)有限公司技術(shù)中心，廣東 潮州515638）

為檢測(cè)奶粉中胞嘧啶核苷酸、尿嘧啶核苷酸、腺嘌呤核苷酸、鳥(niǎo)嘌呤核苷酸、次黃嘌呤核苷酸5種核苷酸的質(zhì)量濃度，建立起奶粉中5種核苷酸的反相離子對(duì)色譜法。樣品經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%乙酸去除蛋白，在流動(dòng)相為1.4 mmol/L四丁基硫酸氫胺含0.01 mol/L磷酸二氫鉀（pH=4.0）∶甲醇=96∶4的條件下用C18色譜柱分離，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm，流速1 mL/min，標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量。5種核苷酸的平均回收率和樣品重復(fù)測(cè)定變異系數(shù)分別是95.7%，96.0%，90.8%，98.7%，99.3%和0.583%，0.147%，0.257%，0.387%，0.167%。該方法無(wú)需進(jìn)行固相萃取，快速靈敏，簡(jiǎn)便準(zhǔn)確，適用于奶粉中核苷酸質(zhì)量濃度的檢測(cè)。

反相離子對(duì)色譜法；奶粉；核苷酸

0 引 言

核苷酸是由含氮的堿基、核糖或脫氧核糖、磷酸3種分子連接而成[1]，是構(gòu)成核酸的成分。目前嬰幼兒奶粉中添加的核苷酸主要有5種：胞嘧啶核苷酸（CMP）、 尿嘧啶核苷酸 （UMP）、 腺嘌呤核苷酸（AMP）、 鳥(niǎo)嘌呤核苷酸 （GMP）、 次黃嘌呤核苷酸（IMP）。雖然核苷酸是嬰幼兒的重要營(yíng)養(yǎng)素，對(duì)其生長(zhǎng)發(fā)育有重要作用，但有一定的含量范圍，過(guò)低起不到應(yīng)有的營(yíng)養(yǎng)作用，過(guò)高則可能對(duì)嬰幼兒正常生長(zhǎng)發(fā)育產(chǎn)生不利影響。所以，建立起適合于嬰幼兒奶粉中核苷酸含量的準(zhǔn)確簡(jiǎn)便的檢測(cè)方法極為重要。

目前，國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)中有許多應(yīng)用高效液相色譜法進(jìn)行核苷酸檢測(cè)的報(bào)道[2-6]，這些方法都難以在企業(yè)中應(yīng)用推廣并將其作為常規(guī)檢測(cè)。

本研究擬在查閱有關(guān)核苷酸檢測(cè)資料的基礎(chǔ)上，結(jié)合嬰幼兒奶粉和當(dāng)前企業(yè)普遍使用的色譜儀器與耗材的特點(diǎn)，建立起檢測(cè)核苷酸質(zhì)量濃度的準(zhǔn)確快捷方法，為企業(yè)常規(guī)檢測(cè)奶粉中核苷酸質(zhì)量濃度提供技術(shù)手段。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 主要儀器

Waters e2695高效液相色譜儀，Waters2489紫外檢測(cè)器，超聲波， C18（250 mm×4.6mm,5 μm）色譜柱。

1.2 試劑

核苷酸標(biāo)準(zhǔn)品：CMP，UMP，GMP，IMP，AMP（純度≥99%），四丁基硫酸氫胺（純度為99.4%），磷酸二氫鉀，磷酸氫二鉀，乙酸，鹽酸，氫氧化鈉，甲醇（色譜純），試劑除指定說(shuō)明，其余均為分析純。

1.3 核苷酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的配置

精確稱取5種核苷酸標(biāo)準(zhǔn)品CMP，UMP，GMP，IMP，AMP各0.010 g，用水定容于100 mL棕色容量瓶中，作為標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。再用水稀釋成一系列標(biāo)準(zhǔn)工作液進(jìn)行色譜分析，以峰面積對(duì)進(jìn)樣濃度進(jìn)行線性回歸。

2 方 法

2.1 色譜條件的建立

（1）色譜柱類型：使用C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱

（2）流動(dòng)相組成：先配置濃度為0.1 mol/L的磷酸氫二鉀，再配置含濃度為0.01 mol/L的磷酸二氫鉀的1.4 mmol/L四丁基硫酸氫胺，并用濃度為0.1 mol/L磷酸氫二鉀調(diào)其pH值以及加入一定體積的甲醇，根據(jù)標(biāo)樣和樣品色譜圖分離情況，確定流動(dòng)相的pH值和甲醇體積比。

（3）其他色譜條件：紫外檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm，流速為1.0 mL/min，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量10 μL。

2.2 樣品的前處理方法

準(zhǔn)確稱取5.00 g樣品,用適量的50℃熱水[1]旋渦混勻溶解，冷卻至室溫后將其放入超聲清洗機(jī)（頻率40 kHz）里超聲10 min，然后溶液轉(zhuǎn)入50 mL容量瓶中,采用3種樣品處理方式沉淀蛋白：質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%乙酸[2]沉淀、質(zhì)量濃度為10 g/L偏磷酸、調(diào)pH值；用超純水定容至刻度，搖勻過(guò)濾，得到清亮的濾液，再使用0.45 μm濾膜過(guò)濾，得樣品濾液并進(jìn)行上機(jī)分析。對(duì)3種沉淀方式進(jìn)行比較。

3 結(jié)果與分析

3.1 色譜條件的選擇

色譜條件的選擇主要涉及到檢測(cè)波長(zhǎng)、色譜柱和流動(dòng)相。5種核苷酸在紫外區(qū)域有吸收，通過(guò)查閱相關(guān)文獻(xiàn)，獲知5種核苷酸在254 nm皆有紫外吸收。目前，C18色譜柱是最常見(jiàn)、用途最廣的反相柱[7]，具有重現(xiàn)性佳，柱效高，易于推廣等作用。核苷酸屬于酸性離子型化合物，要在C18反相色譜住有保留，必須添加陰離子對(duì)試劑，使其與溶質(zhì)離子結(jié)合形成疏水性離子對(duì)化合物，從而能夠在兩相之間進(jìn)行分配，故選擇四丁基硫酸氫胺。反相離子對(duì)色譜常用的流動(dòng)相是以水為主體的緩沖溶液，其pH值對(duì)分離的影響最大。因?yàn)榱鲃?dòng)相的酸堿度決定了被分析物的解離狀態(tài)，從而影響其與離子對(duì)的結(jié)合程度。因此，改變流動(dòng)相的pH值是改善分離選擇性的有效方法。通過(guò)試驗(yàn)摸索，發(fā)現(xiàn)含0.01 mol/L磷酸二氫鉀的1.4 mmol/L四丁基硫酸氫胺[6]在pH=4.0的條件下能分開(kāi)5種核苷酸。

以水為主體的流動(dòng)相中通常添加有機(jī)溶劑，如甲醇、乙腈等作為改性劑，其作用是改善締合分子在兩相中的分配。在確定離子對(duì)試劑的濃度（1.40 mmol/L）和流動(dòng)相的pH＝4.0后，又對(duì)含離子對(duì)試劑的緩沖鹽溶液與甲醇的體積分?jǐn)?shù)比為90∶10，92∶8，94∶6，96∶4，98∶2的流動(dòng)相進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明：加入甲醇的體積對(duì)5個(gè)組分峰的保留時(shí)間影響較大，而且對(duì)5個(gè)組分峰影響的程度不一樣，并直接影響出峰順序及分離度。試驗(yàn)結(jié)果表明，含離子對(duì)試劑的緩沖鹽溶液與甲醇的體積分?jǐn)?shù)比為96∶4的流動(dòng)相對(duì)5種核苷酸的分離度效果較好。因而，得到的最佳分析條件是使用C18色譜柱，離子對(duì)試劑四丁基硫酸氫銨濃度為1.4 mmol/L且含0.01 mol/L磷酸二氫鉀，甲醇體積分?jǐn)?shù)為4%，pH值為4.0，如圖1所示。

3.2 樣品前處理方式的選擇

樣品的前處理主要考慮的是既能將樣品中的蛋白質(zhì)分離出去，又能將核苷酸無(wú)損失的提取出來(lái)。為此我們將樣品用水溶解，通過(guò)超聲波振蕩后采用3種樣品處理方式來(lái)沉淀蛋白質(zhì)：10%乙酸、15 g/L偏磷酸、調(diào)pH值。酸法沉淀蛋白的方法是將充分振蕩溶解的樣品轉(zhuǎn)入50 mL容量瓶中，加入5 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的乙酸溶液或5 mL質(zhì)量濃度為15 g/L偏磷酸，定容，充分混勻后用濾紙過(guò)濾；調(diào)pH值法沉淀蛋白質(zhì)的方法是先用稀鹽酸溶液將充分振蕩溶解的樣品溶液的pH值調(diào)至1.7，靜止1 min后再用氫氧化鈉調(diào)pH值至4.5后轉(zhuǎn)入50 mL容量瓶，定容，混勻，用濾紙過(guò)濾。上述濾液通過(guò)0.45 μm的濾膜過(guò)濾后上機(jī)測(cè)定。通過(guò)對(duì)測(cè)定色譜圖進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)：上述3種處理方式對(duì)色譜圖中雜質(zhì)峰的數(shù)量和色譜峰形及分離度都有一定的影響，調(diào)pH值和加入偏磷酸沉淀蛋白質(zhì)的試液雜質(zhì)峰要多于用乙酸沉淀蛋白質(zhì)的方法。使用乙酸沉淀蛋白效果最好，色譜峰的峰形和分離度最好，而且方便。根據(jù)上述處理樣品方法的比較，確定采用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%乙酸沉淀蛋白質(zhì)的樣品處理方法，如圖2所示。

3.3 方法的精密度、線性關(guān)系和準(zhǔn)確度

按照既定條件連續(xù)5次測(cè)定同一樣品，用峰面積相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差計(jì)算精密度，結(jié)果如表1所示。將核苷酸系列標(biāo)準(zhǔn)工作液按上述色譜條件進(jìn)樣10 μL，以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，通過(guò)回歸計(jì)算求得回歸方程和相關(guān)系數(shù)，結(jié)果如表2所示。準(zhǔn)確度用樣品的回收率來(lái)評(píng)價(jià)，以5個(gè)樣品為實(shí)驗(yàn)材料，加入核苷酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，然后按上述操作步驟進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定結(jié)果如表3所示。

表1 精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表2 核苷酸標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定結(jié)果

表3 奶粉中核苷酸回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

4 結(jié) 論

采用反相離子對(duì)高效液相色譜法對(duì)奶粉中核苷酸質(zhì)量濃度進(jìn)行測(cè)定，方法無(wú)需進(jìn)行固相萃取和特殊設(shè)備，快速靈敏，操作簡(jiǎn)便，易于掌握，其測(cè)定精密度和準(zhǔn)確度能滿足乳制品分析的要求。因此，可作為常規(guī)檢測(cè)方法應(yīng)用。

[1]揚(yáng)大進(jìn)，方從容，馬蘭，等.嬰幼兒配方奶粉中核苷酸含量的測(cè)定方法研究[J].中國(guó)食品衛(wèi)生雜志，2003，15(6):497.

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Determination of nucleotides in infant formula milk powder by reversed-phase ion pair chromatography

XU Bin,ZHANG Shi-hua
(Guangdong Yashili Group Co.,Ltd Technology Center，Chaozhou 515638,China)

For the determination of 5 nucleotides amount in infant formula milk powder,the Reversed-Phase Ion Pair Chromatography detector method was established.We established the method in which 10%acetic acid was used for elimination of protein,C18 column and the liquid phase of 1.4 mmol/L Tetarbutylammonium hydrogen sulfate(0.01 mol/L KH2PO4and pH=4.0)for isolation and the nucleotides were determined quantitatively by standard curve method at the UV 254nm and the flow of 1 mL/min.The average recovery rates of cytidine,uridine,adenosine,guanosine and inosine were 95.7% 、96.0% 、90.8% 、98.7% 、99.3%,respectively and the coefficient variance were 0.583% 、0.147%、0.257%、0.387%、0.167%.Without SPE,the method was able to quickly,accurate and sensitive detect nucleotides amount in infant formula milk powder.

Reversed-Phase Ion Pair Chromatography；milk powder；nucleotides

TS252.7

A

1001-2230（2012）04-0045-03

2011-12-20

許彬(1983-)，男，工程師，研究方向?yàn)槭称钒踩褪称窓z測(cè)技術(shù)。