銀杏抗寒優良無性系選育

郁萬文，曹福亮，汪貴斌

（南京林業大學 森林資源與環境學院， 江蘇 南京 210037）

銀杏抗寒優良無性系選育

郁萬文，曹福亮，汪貴斌

（南京林業大學 森林資源與環境學院， 江蘇 南京 210037）

采用-20℃低溫處理方法, 分析了39個銀杏無性系枝條的LT50，可溶性糖含量、可溶性蛋白含量，SOD活性等指標的變化。運用多元統計主成分分析，初步判斷受試材料抗寒性，由強到弱排序為: 16#、38#、17#、40#、41#、36#、45#、15#、53#、44#、19#、42#、57#、10#、35#、18#、50#、55#、32#、26#、12#、30#、56#、9#、13#、34#、12#、37#、14#、33#、54#、20#、28#、11#、31#、27#、29#、39#。其中抗寒性較高的銀杏無性系有16#、41#、36#、45#、19#、17#、38#、40#，表現為較好的保水能力、抗氧化能力和滲透調節能力，從而表現出較強的抗寒力，具有在高緯度或高海拔地區推廣試驗的潛力。

銀杏；無性系；冰凍脅迫；抗寒性；選育

選用抗寒性較強的樹種、種源、品種或無性系等是解決樹木引種受凍的根本途徑。不同種類、同一種類不同品種、同一品種不同生育期、不同器官、組織等抗寒力均表現出極大差異[1]。不同銀杏單株、品種、無性系的遺傳背景和生境存在較大差異, 因此在植株形態、抗寒性等方面均表現不同。其中抗寒性差異直接影響銀杏在高緯度或高海拔地區的引種和種植，因此在高緯度或高海拔地區引種銀杏之前，對引種無性系或品種進行抗寒性檢測是必須的。在極端氣候下，一個樹種大面積受凍害死亡或樹勢衰弱，而保留下來的健壯單株則具有相當的抗寒性，將這種單株做為母本，經過抗寒力測定、選育，就可得到優良的抗寒無性系。因此，常有凍害發生的地區，引種銀杏的同時，對各品種或無性系的抗寒力要做到胸中有數，選擇抗寒力強的品種作為下期引種的對象，同時要特別注意引種地抗寒力強的品種、品系、無性系引種范圍的擴大，爭取從根本上解決銀杏高緯度和高海拔引種受凍問題。本研究用-20℃對39個嫁接18年生的優良核用無性系的越冬枝條進行冰凍處理，測定其相關的生理生化指標，對39個核用無性系的抗寒性進行綜合評定，初步篩選出抗寒性較強的無性系，為下一步在高海拔、高緯度地區的區組試驗及銀杏邊緣分布區的引種提供理論依據和抗寒種質資源。

1 材料與方法

1.1 供試材料

材料來源于江蘇省邳州市陳樓鎮銀杏種質資源圃，為嫁接18年生的39個核用銀杏無性系。

1.2 方法

2008年1月20日采集生長健壯、粗細均勻的樹冠外圍的一兩年生枝條，用自來水沖洗數遍，再用蒸餾水沖洗3次，然后用吸水紙吸干水分，最后將枝條末端進行蠟封，將每個無性系蠟封后的枝條分成相等的8份，其中1份用于低溫處理，剩余7份用于半致死溫度測定，放于冰箱中4℃保存。每次處理時，取參試材料的1份枝條放于程控冰箱內進行-20℃冰凍處理，降溫速度4℃/h，達到目的溫度后維持24 h, 然后逐步升溫，升溫速度亦為4℃/h。每處理重復3次。

表1 銀杏核用無性系編號及原產地Table 1 Number and origin place of stone-used ginkgo strains

1.2.1 相對電導率的測定和半致死溫度估算

稱量每個無性系枝條7份，每份10.0 g剪成1.0 cm小段，密封在塑料標本袋內。1份在室溫下測定電導率作為對照(CK)，另外6份放入超低溫冰箱內進行冰凍處理。冰凍處理溫度分別為-15℃、-20℃、-25℃、-30℃、-35℃和-40℃。冷凍時降溫幅度和解凍時的升溫幅度都為4℃/h，冷凍到達所處理的溫度后，維持24 h，然后解凍，3次重復。相對電導率的測定和半致死溫度的估算參照焦奎寶等[2]的方法。

1.2.2 生理生化指標測定

采用蒽酮比色法測定淀粉和可溶性總糖含量，考馬斯亮藍法測定可溶性蛋白含量，磺基水楊酸法測定脯氨酸含量，均參照李合生的方法[3]，略有改動。超氧物岐化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)、丙二醛(MDA )和氧自由基(·O2-)產生速率的測定參照文獻[4]的方法，略有改動。

采用多元統計主成分分析對39個銀杏無性系進行分析，計算銀杏無性系抗寒力，對銀杏無性系的抗寒性進行分類，并進行分析討論。

2 結果與分析

2.1 不同銀杏無性系抗寒指標的差異

2.1.1 不同銀杏無性系半致死低溫的差異

如表2所示，不同銀杏無性系枝條的LT50差異達到極顯著水平(P＜0.01)（見表3）。其中16#無性系的LT50最高，為-29.06℃，28#無性系的LT50最低，為-18.94℃，兩者相差10.12℃。供試的39個核用無性系的LT50由低到高的順序(見表2)是 16#、17#、38#、40#、53#、44#、15#、42#、45#、36#、57#、43#、19#、41#、18#、13#、10#、30#、35#、50#、33#、56#、26#、9#、20#、55#、32#、54#、37#、34#、11#、21#、14#、31#、12#、29#、27#、39#、28#。

2.1.2 不同銀杏無性系可溶性糖含量的差異

如表2和表3所示，不同銀杏無性系枝條的可溶性糖含量差異性顯著(P＜0.05)。其中17#的可溶性糖含量最高，為2.78 mg/gFW，39#的最低，為1.52 mg/gFW，兩者相差0.83倍。供試的39個核用無性系的可溶性糖含量為39#＜29#＜54#＜27#＜20#＜11#＜31#＜34#＜13#＜21#＜18#＜9#＜26#＜55#＜28#＜37#＜56#＜33#＜12#＜32#＜14#＜50#＜53#＜30#＜42#＜10#＜57#＜35#＜43#＜15#＜19#＜44#＜36#＜45#＜38#＜40#＜16#＜41#＜17#。

表2 不同銀杏無性系枝條抗寒指標?Table 2 Cold-resistance indexes of different ginkgo clones

2.1.3 不同銀杏無性系可溶性蛋白含量的差異

由表2和表3可知，不同銀杏無性系枝條的可溶性蛋白含量差異性顯著 (P＜0.05)。其中16#的可溶性蛋白含量最高，為9.19 mg/gFW，39#的最低，為4.33 mg/gFW，兩者相差1.12倍。供試的39個核用無性系的可溶性蛋白含量由低到高的 順 序 ( 表2) 是 39#、29#、20#、27#、11#、37#、13#、31#、33#、54#、12#、21#、28#、14#、26#、34#、50#、32#、9#、30#、56#、55#、35#、18#、43#、42#、57#、19#、40#、10#、36#、53#、44#、17#、45#、15#、38#、41#、16#。

2.1.4 不同銀杏無性系SOD活性的差異

如表2和表3所示，不同銀杏無性系枝條的SOD活性差異不顯著(P＞0.05)。其中38#無性系的SOD活性最高，為323.52 U/gFw，54#無性系的最低，僅為84.12 U/gFw。供試的39個核用無性系的SOD活性的順序(表2)是38#＞41#＞16#＞36#＞17#＞40#＞35#＞45#＞15#＞44#＞53#＞19#＞42#＞57#＞10#＞34#＞30#＞43#＞12#＞55#＞32#＞50#＞26#＞56#＞9#＞18#＞21#＞28#＞14#＞33#＞20#＞37#＞13#＞29#＞27#＞39#＞11#＞31#＞54#。

其他抗寒指標不再一一詳述，詳見文獻5。對其他抗寒指標進行方差分析，結果表明，39個銀杏無性系的失水率、H2O2含量、MDA含量的差異性均達到極顯著性平(見表3)，相對電導率、淀粉含量的差異性顯著，而游離脯氨酸含量、POD活性、產生速率的差異性不顯著。

表3 不同銀杏無性系抗寒指標方差分析Table 3 Variance analysis on cold-resistance indexes of 39 ginkgo strains

2.2 銀杏無性系抗寒指標間相關性分析

對39個銀杏無性系的12個抗寒指標進行相關分析，其抗寒生理化指標的相關陣(見表4)。由表4可知，半致死溫度與可溶性糖含量、可溶性蛋白含量、Pro含量、SOD活性、POD活性呈極顯著負相關，失水率、電導率、生速率、H2O2和MDA含量與半致死溫度呈極顯著正相關，說明銀杏枝條在冰凍脅迫下通過增加保護酶(SOD、POD)活性和滲透調節物質(可溶性糖、蛋白質和Pro)含量，來降低膜脂的過氧化(MDA)，維持膜的穩定性(相對電導率)，從而提高銀杏的抗寒性。另外，SOD和POD活性分別與·O·-產生速率和H2O2含量呈極顯著負相關，而H2O2含量與MDA含量則呈極顯著正相關，表明冰凍低溫下銀杏枝條通過保護酶活性的提高，降低活性氧在體內的積累，防止膜脂的過氧化作用。

表4 各抗寒指標間的相關系數Table 4 Correlation coeffeients of cold-resistance indexes

2.3 抗寒指標主成分分析

采用主成分分析方法，對39個銀杏無性系進行抗寒性指標綜合評價。主成分分析的數據由表5和表6提供。根據累積貢獻率≥85.00%的標準，本研究中有3個主成分入選，其累積貢獻率為86.18%，前3個主成分已反映了12個抗寒指標的絕大部分信息，因此，只需討論前3個主成分即可。

表5 各主成分的特征根和貢獻率Table 5 The eigenvalues and pereentage aeeumulated contribution of the 3 prineipal components

由表6可見，第一主分量中X4、X5、X6、X7、X8、X9為正向 載荷，Xl，X2、X3、X10、X11、X12為負向載荷，各指標對第一主分量的貢獻較為均勻，表明第一主分量是反映銀杏無性系在低溫下生理生化發生逆變的綜合指標。銀杏枝條在低溫脅下通過增強抗氧化能力(提高SOD、POD活性)和滲透調節能力(可溶性糖、Pro、可溶性蛋白質含量增加)，來降低膜脂的過氧化(MDA)，維持膜的穩定性(相對電導率)，從而提高銀杏的抗寒性。第二主分量主要反映了失水率與抗寒性的關系。第三主分量主要反映了枝條電導率和淀粉含量與抗寒性的關系。

2.4 銀杏無性系抗寒性劃分

選用前兩個主成分得分值繪制二維坐標圖（見圖1）。根據二維坐標圖，39個銀杏無性系抗寒性強弱可劃分為3大類：第一類，抗寒性強{16#、41#、36#、45#、19#、17#、38#、40#}；第二類，抗寒性較強 {35#、10#、42#、57#、44#、43#、53#、15#}；第三類，抗寒性中等 {9#、26#、13#、30#、50#、18#、56#、33#}；第四類，抗寒性弱 {11#、29#、20#、31#、54#、12#、27#、37#、32#、55#、34#、14#、21#、28#、39#}。

表6 前3個主成分分析因子載荷Table 6 Load of principal components of first 3 factors

對上述4類無性系的指標進行分析，第一、二類，尤其是第一類，具有較好的保水能力、抗氧化能力和滲透調節能力，從而表現出較強的抗寒力，其中第一類具有在高緯度地區推廣試驗的潛力。第三類，相對電導率和H2O2含量最高，推測高水平的H2O2，破壞了膜的半透性，造成低溫脅迫下枝條中內含物的大量外滲，表現為相對電導率很高，致使該類抗寒性較差。第四類，保水能力、抗氧化能力和滲透調節能力均較差，從而表現出較差的抗寒性。

表7 銀杏無性系的前3個主成分的得分值Table 7 The values of the first 3 prineipal components

圖1 主成分分析二維坐標Fig.1 Two dimensional coordinate graphs of principal component analysis

2.5 銀杏無性系抗寒性排序

表7列出了39個銀杏無性系的主成分值和表5列出的貢獻率，根據公式Σni=1AjBj(A:主成分貢獻率，B：銀杏無性系主成分值，j:1～3,n:39)，可求出39個無性系抗寒性大小及抗寒力順序(見表8)。39個銀杏無性系抗寒力的順序如下：16#＞38#＞17#＞40#＞41#＞36#＞45#＞15#＞53#＞44#＞19#＞42#＞57#＞10#＞35#＞18#＞50#＞55#＞32#＞26#＞12#＞30#＞56#＞9#＞13#＞34#＞12#＞37#＞14#＞33#＞54#＞20#＞28#＞11#＞31#＞27#＞29#＞39#。

表8 銀杏無性系抗寒力排序Table 8 Cold resistance ability ranking of ginkgo strains

3 討論與結論

在冰凍低溫下，如何有效的避免胞內結冰是林木抵抗冰凍脅迫的第一步。低溫脅迫下, 植物體的抗寒性越強, 可溶性蛋白含量也越高。可溶性糖能夠減少低溫對細胞的傷害, 在低溫下討論可溶性糖含量時, 常常提及可溶性蛋白含量, 它們常作為鑒定植物抗寒性的指標[6]。植物體內游離脯氨酸對機體器官具有保護作用, 可作為植物抗寒性測定的指標。許多研究表明,這些物質具有降低細胞的滲透勢和組織冰點，穩定膜系統，保護蛋白質和調節抗性基因表達等多方面的作用，與抗寒性變化密切相關[7-8]。本研究表明，越冬過程中，銀杏枝條主動轉化生成大量的可溶性糖、Pro等滲透調節物質，調節細胞中滲透勢，降低組織冰點，保護蛋白質。同時低溫誘導抗寒基因的表達，合成了大量與抗寒相關的蛋白類物質，如抗寒蛋白、抗寒調控性酶類，造成可溶性蛋白質含量的增加。

低溫脅迫會使植物體自由基產生速率升高[9]、清除劑含量降低[10]、清除酶類的活性不均衡的降低[11-12]，植物細胞內活性氧的積累，引發膜脂過氧化、交聯蛋白質和攻擊DNA等，而且其氧化產物多會對植物造成嚴重的傷害。大量研究表明，低溫鍛煉可誘導植物體內活性氧清除酶類的活性提高或增加其在低溫下的穩定性，提高體內的活性氧清除劑，如SOD、POD、GSH活性，從而有效地避免活性氧對蛋白尤其是酶蛋白傷害[8-9,13]。本研究表明，低溫脅迫下銀杏體內保護酶類，SOD、POD等活性升高，有效地清除活性氧自由基的產生，維持較好的活性氧代謝平衡，且酶活性高的無性系其抗寒性強，這與闡文靖等[14]的研究結果一致。

綜上所述，部分銀杏無性系的枝條在低溫脅下能夠通過增強抗氧化能力(提高SOD、POD活性)和滲透調節能力(可溶性糖、Pro、可溶性蛋白質含量增加)，來降低膜脂的過氧化(MDA)，維持膜的穩定性(相對電導率)，表現出較強的抗寒性。39個銀杏無性系枝條抗寒性的順序是16#、38#、17#、40#、41#、36#、45#、15#、53#、44#、19#、42#、57#、10#、35#、18#、50#、55#、32#、26#、12#、30#、56#、9#、13#、34#、12#、37#、14#、33#、54#、20#、28#、11#、31#、27#、29#、39#。其中抗寒性較高的銀杏無性系有16#、41#、36#、45#、19#、17#、38#、40#，表現為較好的保水能力、抗氧化能力和滲透調節能力，從而表現出較強的抗寒力。所以這8個無性系具有在高緯度地區推廣試驗的潛力。

[1] 劉 艷,李曉燕,王麗雪,等.蘋果枝條冬季淀粉粒動態變化與抗寒力的關系[J].內蒙古農業大學學報,2006,27(2):79-83.

[2] 焦奎寶,高慶玉.葡萄嫁接苗根系低溫半致死溫度的測定[J].黑龍江農業科學,2010, (3):67-68.

[3] 李合生.植物生理生化實驗原理和技術[M].北京:高等教育出版社,2000.

[4] 中國科學院上海植物生理研究所,上海市植物生理學會.現代植物生理學實驗指導[M].北京:科學出版社,1999.

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Selection and breeding of Ginkgo cold-resistant fi ne clones

YU Wan-wen, CAO Fu-liang, WANG Gui-bin
(College of Forest Resources and Environment, Nanjing Forestry University, Nanjing 210037, Jiangsu, China)

By using -20℃low temperature processing methods, the changes of semilethal temperature, soluble sugar, soluble protein contents, SOD activity and others of 12 indexes measured for 39 Ginkgo clones branches were analyzed. The cold resistant performance of the tested materials were sorted from strong to weak : 16#,38#,17#,40#,41#,36#,45#,15#,53#,44#,19#,42#,57#,10#,35#,18#,50#,55#,32#,26#,12#,30#,56#,9#,13#,34#,12#,37#,14#,33#,54#,20#,28#,11#,31#,27#,29# and 39#. Of them, the clones having relatively stong cold resistant were 16#,41#,36#,45#,19#,17#,38# and 40#, they had good water retaining capacity, antioxidant capacity and osmotic regulation ability, thus they showed a relatively stong cold resistant, and have the potentiality of popularizing and planting in high latitudes or high altitude areas.

Ginkgo; clones; freezing stress; cold resistance; selection and breeding

S722.1+3

A

1673-923X(2012)12-0132-07

2012-06-13

高校博士點專項基金項目“銀杏三個脂肪酸去飽和關鍵酶基因的克隆、表達與載體構建”( 20113204120007)；國家科技支撐計劃課題“銀杏和印楝珍貴材用和藥用林定向培育關鍵技術研究與示范”(2012BA021D04)；林業公益性行業科研項目“銀杏葉和外種皮加工產業化關鍵技術研究”（201004015）資助

郁萬文( 1979-)，男，山東臨沂人，博士，講師，主要從事經濟林栽培的研究。E-mail: youeryuww@163. com

曹福亮(1957-),男，江蘇姜堰人，博士導師，教授，主要從事經濟林培育與加工研究

[本文編校：羅 列]