凹葉厚樸離體胚培養(yǎng)的研究

王志毅，馬英姿，王曉明，宋 榮 ，張 慧

(1.中南林業(yè)科技大學 生命科學與技術學院，湖南 長沙 410004; 2. 湖南省林業(yè)科學院，湖南 長沙 410004)

凹葉厚樸離體胚培養(yǎng)的研究

王志毅1，馬英姿1，王曉明2，宋 榮1，張 慧1

(1.中南林業(yè)科技大學 生命科學與技術學院，湖南 長沙 410004; 2. 湖南省林業(yè)科學院，湖南 長沙 410004)

為了滿足市場的資源需求，建立優(yōu)質(zhì)凹葉厚樸離體再生體系，為凹葉厚樸工廠化生產(chǎn)提供理論依據(jù)，以優(yōu)質(zhì)凹葉厚樸離體胚為外植體，以B5為基本培養(yǎng)基，6-BA、NAA、消毒時間為因素，采用L9(33) 正交設計，進行無菌苗培養(yǎng)優(yōu)化試驗。結(jié)果表明：最佳消毒方法為0.1%升汞浸泡8 min，污染率為12.6%，外植體生長良好；最佳組合為B5+ 6-BA 0.5 mg/L + NAA 0.1 mg/L + 消毒時間8 min，發(fā)芽率高達87%。

凹葉厚樸；正交設計；再生體系；發(fā)芽率

凹葉厚樸Magnolia off i cinalissubsp.biloba，為厚樸Magnolia off i cinalis的亞種，是中國特有的木蘭科木蘭屬植物。在中藥生產(chǎn)中，厚樸及凹葉厚樸都統(tǒng)稱為厚樸，是中國傳統(tǒng)的大宗中藥材，其根皮以及枝皮都可入藥，具有燥濕消痰等功效，用于食積氣滯，腹脹便秘，痰飲喘咳[1]。厚樸酚（Magnolol）與和厚樸酚（Honokiol）是主要活性成分，具有多種藥理作用，包括抗炎，抗心律失常，抗癲癇，抗血小板，抑制肌肉收縮和抗菌等。由于資源保護不利，野生厚樸（凹葉厚樸）已瀕臨枯竭，在20世紀80年代，已被國家定為Ⅱ級保護植物和Ⅱ級保護野生中藥材。由于資源的不斷減少，大批生長年限不足的厚樸（凹葉厚樸）被提前砍伐，造成藥材整體質(zhì)量下降，《中華人民共和國藥典》對厚樸（凹葉厚樸）有效成分厚樸總酚的含量規(guī)定也由3%降到了2%，這種情況在國家標準制訂的歷史中是罕見的[2]。湖南永州產(chǎn)凹葉厚樸有效成分含量高，植株優(yōu)良。利用生物技術方法對優(yōu)質(zhì)凹葉厚樸進行快速繁殖研究、實現(xiàn)規(guī)模化生產(chǎn)是解決資源不足的有效途徑[3-4]。本研究對凹葉厚樸離體胚進行培養(yǎng)，獲取最佳培養(yǎng)方法，為進一步規(guī)模化生產(chǎn)奠定了基礎[5-7]。

1 材料與方法

1.1 材 料

試驗材料來自湖南永州產(chǎn)優(yōu)質(zhì)凹葉厚樸，采其種子作為外植體。

1.2 方 法

1.2.1 外植體處理

用解剖刀夾破種殼，取出胚囊，然后依次用75%酒精進行表面消毒15～30 s、無菌水漂洗3～4次、0. 1% 氯化汞消毒6～10 min、無菌水再次漂洗5～6次，最后用無菌濾紙或紗布吸干、備用[8-9]。

1.2.2 不同種類及質(zhì)量濃度的激素選擇

通過單因素預實驗，得出B5培養(yǎng)基最適合外植體生長，細胞分裂素6-BA，KT和細胞生長素NAA，?BA對外植體的生長起到促進作用。因此在相同基本培養(yǎng)基上分別添加兩種激素進行雙因素試驗，統(tǒng)計每組的發(fā)芽率和污染率，從而選擇適合的激素種類和質(zhì)量濃度組合。

1.2.3 最佳配比方案選擇

在對適合的細胞分裂素和生長素及質(zhì)量濃度選擇后，設計正交試驗，分別以細胞分裂素，細胞生長素和消毒時間為3因素，不同質(zhì)量濃度和時間分別設計3個水平，同時采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件對試驗數(shù)據(jù)進行方差分析，LSD法對各因素各個水平之間進行多重比較[10-11]，確定最佳配比方案。

1.3 培養(yǎng)基制作

制備B5固體培養(yǎng)基，調(diào)pH 值為5. 8～6. 0，用廣口瓶分裝，置于LDZX-40Ⅱ型自動電熱壓力蒸汽滅菌鍋，于1. 06 kg/cm2的壓力下121 ℃消毒2 h[12]。

1.4 培養(yǎng)方法及條件

采用B5固體培養(yǎng)基：瓊脂6. 5～7.0 g/L，蔗糖25 g/L，pH值5. 8～6.0，于( 25±1)℃、暗培養(yǎng)8～10 d 后，再進行光照培養(yǎng)（2 000 lx），15 d 后統(tǒng)計發(fā)芽率[13]。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同種類及質(zhì)量濃度的激素對離體胚培養(yǎng)的影響

將消毒處理后的凹葉厚樸離體胚在B5固體培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，同時添加不同種類及質(zhì)量濃度的細胞分裂素和生長素，定期觀察離體胚的生長情況，統(tǒng)計發(fā)芽率和污染率[14]，試驗結(jié)果見表1～3。

通過表1和表2可知，當保持生長素NAA 質(zhì)量濃度一致，改變分裂素6-BA 的質(zhì)量濃度時，平均發(fā)芽率為51.25%，最高發(fā)芽率為68%；而用分裂素KT時，平均發(fā)芽率為45.75%，最高發(fā)芽率僅為62%，并且各質(zhì)量濃度的6-BA對芽的誘導率都要高于相應質(zhì)量濃度KT，這足以說明6-BA 對發(fā)芽率的影響要比KT的更為顯著。

比較分析表1 和表3，當每組分裂素6-BA 的質(zhì)量濃度保持一致時，取相同質(zhì)量濃度的生長素NAA、?BA 作對比試驗：結(jié)果表明NAA 對發(fā)芽率的誘導效果好于?BA。因此，選用分裂素6-BA 和生長素NAA 作為進一步培養(yǎng)的激素種類。

表1 6-BA 與NAA 的組合Table 1 Combination of 6-BA and NAA

表2 KT 與NAA 組合Table 2 Combination of KT and NAA

表3 6-BA 與?BA 組合Table 3 Combination of 6-BA and IBA

2.2 最佳培養(yǎng)方案的確定

確定分裂素和生長素種類后，選擇因素A ：6-BA (0.5、1.0、0.1 mg·L-1) ， 因 素 B ：NAA(0.05、0.1、0.2 mg·L-1) ，因素 С ：消毒時間(6、8、10 min) ，3因素3 水平，選用 L9(33) 正交表做正交試驗(見表4)，同時采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件對試驗數(shù)據(jù)進行方差分析，LSD法對各因素各個水平之間進行多重比較[15](見表5)。

通過表4 的數(shù)據(jù)分析，可以得出各因素內(nèi)各個水平之間的極差(R)。極差的大小反映了該因素的影響程度，極差大的因素對實驗結(jié)果的影響也大。從R的大小可知，對發(fā)芽率影響因素的大小依次是：6-BA＞ NAA＞消毒時間。從表4 還可得出各因素的最優(yōu)水平組合即6-BA：0.5 mg/L，NAA：0.1 mg/L，消毒時間：8 min，該組合方式對凹葉厚樸離體胚培養(yǎng)的發(fā)芽率可高達87% 。

表5則顯示出方差分析結(jié)果： 因素A (6-BA)和因素B (NAA) 對胚發(fā)芽率影響顯著(P≤0.05)。經(jīng)LSD 多重分析比較得出：因素A (6-BA) 的各個水平之間存在顯著差異(P＜ 0.05)；因素B (NAA)的水平1、2（0.05、0.1 mg·L-1) 之間無顯著差異（P＞ 0. 05），水平 2、3（0.1、0.2 mg·L-1) 之間和 1、3（0.05、0.2 mg·L-1) 之間均存在顯著差異 (P＜0.05)；因素С（消毒時間）各個水平之間也無顯著差異 (P＞ 0. 05)。

表4 L9(33)正交試驗結(jié)果Table 4 Results of L9(33) orthogonal test

表5 L9(33)正交試驗的方差分析Table 5 Variance analsis of L9(33) orthogonal tests

綜上分析，在凹葉厚樸離體胚培養(yǎng)的過程中，分裂素6-BA選用0.5 mg/L，生長素NAA選用0.05或0.1 mg/L ，消毒時間 ( 6、8、10 min) 對結(jié)果的影響差異不顯著。從正交試驗的方差分析可知：生長素NAA在0.05～0.1 mg/L都適合離體胚的生長，但從無菌苗的生長勢來看，NAA 為0.1 mg/L時生長勢較好(圖1、圖2)，因而激素NAA濃度選用0.1 mg/L。

圖1 NAA 0.05 mg/L,25 d后的生長情況Fig. 1 Growth condition of M. officinalis with NAA 0.05 mg/L,after 25 days

圖2 NAA 0.1mg/L,25d后的生長情況Fig. 2 Growth condition of M. officinalis with NAA 0.1 mg/L, after 25 days

3 小 結(jié)

本研究對適合凹葉厚樸離體胚生長的激素種類及濃度分別進行了雙因素試驗和正交試驗，從中篩選凹葉厚樸離體胚最適培養(yǎng)基。由正交試驗和方差分析結(jié)果可知，6-BA、NAA、消毒時間3因素的最佳水平組合為B5+ 6-BA 0.5 mg/L + NAA 0.1 mg/L+ 消毒時間8 min，發(fā)芽率高達87%。該結(jié)果也為今后凹葉厚樸優(yōu)質(zhì)資源再生體系構(gòu)建以及次生代謝研究等方面奠定了良好的基礎[16-17]。

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In vitro embryonic culture of Magnolia off i cinalis subsp. biloba

WANG Zhi-yi1, MA Ying-zi1, WANG Xiao-ming2, SONG Rong1, ZHANG Hui1
(1. School of Life Science and Technology, Сentral South University of Forestry & Technology, Сhangsha 410004,Hunan,Сhina;2. Hunan Academy of Forestry, Сhangsha 410004, Hunan,Сhina)

?n order to satisfy the market’s demands for the resources ofMagnolia officinalissubsp.biloba (Rehd.et Wils.)Law., set up a high quality rapid propagation regeneration system ofM. officinalis, and provide a theoretical basis for factory production，the optimization tests of aseptic seedling culture onM. off i cinalishave been carried out by using its embryos as in vitro culture material,adopting orthogonal design L9(34) method, and setting up 6-BA, NAA and disinfected time as the three main factors (every factor having 3 levels) . The results indicate that the best disinfect method was to sterilize the explants by mecruric chloridein （0.l%）for 8 minutes,and the optimum combination was B5+ 6-BA 0.5 mg/L + NAA 0.1 mg/L+ 8 minutes (disinfection time), its germination rate reached 87%.

Magnolia off i cinalissubsp.biloba; orthogonal design; regeneration system ; germination rate

S727.34

A

1673-023X (2012)05-0050-04

2011-12-06

國家行業(yè)科研專項(201104023) ；湖南省研究生教改項目(JG2011B027)；湖南省科技廳項目(2011NK3042)

王志毅(1985-)，女，河南新鄉(xiāng)人，碩士研究生，研究方向為資源植物的開發(fā)與利用；E-mail: hnxxwzy@163.com

馬英姿(1967-)，女，河南鞏義人，副教授，博士，研究方向為資源植物的開發(fā)與利用；E-mail: ma_yingzi@163.com

[本文編校：吳 毅]