高產Nisin和高產LAB EPS乳酸菌共生株篩查

弓耀忠 王 呈

（山西省食品質量監督檢驗中心，太原 030012）

高產Nisin和高產LAB EPS乳酸菌共生株篩查

弓耀忠*王 呈

（山西省食品質量監督檢驗中心，太原 030012）

通過對10株產Nisin乳酸菌株和10株產LAB EPS乳酸菌株進行培養、篩選和測定，篩選出3株高產Nisin的乳酸菌株和3株高產LABEPS的乳酸菌株，進而對3株高產LAB EPS乳酸菌株和3株高產Nisin乳酸菌株進行復合發酵試驗，最終篩選出可共生的高產Nisin乳酸菌株和高產LAB EPS乳酸菌株各1株。

Nisin；LAB EPS；乳酸菌；共生

乳酸鏈球菌素（Nisin） 亦稱乳酸鏈球菌肽或音譯為尼辛，是乳酸鏈球菌產生的一種多肽物質，由34個氨基酸殘基組成。食用后在人體的生理pH條件和α-胰凝乳蛋白酶作用下很快水解成氨基酸，不會改變人體腸道內正常菌群以及產生如其他抗菌素所出現的抗性問題，更不會與其他抗菌素出現交叉抗性，是一種高效、無毒、安全、無副作用的天然食品防腐劑。可廣泛應用于肉制品、乳制品、罐頭、海產品、飲料、果汁飲料、液體蛋及蛋制品、調味品、釀酒、烘焙食品、方便食品、香基香料、化妝品等中。

胞外多糖(exopolysaccharides，EPS)：是一些特殊微生物在生長代謝過程中分泌到細胞壁外、易與菌體分離、分泌到環境中的水溶性多糖，屬于微生物的次級代謝產物，對微生物的生長有重要意義。

目前關于乳酸鏈球菌素和胞外多糖已有大量的文獻報道，但研究高產乳酸鏈球菌素菌株和高產胞外多糖菌株之間共生關系的文獻鮮有報道。本文通過對10株產Nisin乳酸菌株和10株產LAB EPS乳酸菌株進行培養、篩選和測定，篩選出3株高產Nisin的乳酸菌株和3株高產LAB EPS的乳酸菌株，進而對3株高產LAB EPS乳酸菌株和3株高產Nisin乳酸菌株進行復合發酵試驗，最終篩選出可共生的高產Nisin乳酸菌株和高產LAB EPS乳酸菌株各1株。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

本試驗所用的乳酸菌株為乳酸乳球菌（Lactococcus lactis subsp.lactis），其菌種編號為 LA02、LA03、LA04、LA05、LA06、LA07、LA08、LA09、LA10、LE03、LE04、LE05。所用明串珠菌(Leuconostoc lactis)菌種編號為 Leu02、Leu03、Leu04、Leu05、 Leu06、 Leu07、 Leu08、 Lvan02、 Lvan04、Lvan05。

1.1.2 培養基

1.1.2.1 菌株保藏及傳代培養基

MRS培養基、MC培養基。

1.1.2.2 種子培養基、發酵培養基

MC培養基。

1.1.2.3 乳鏈菌肽效價測定培養基

以質量分數計：胰蛋白胨0.8%、酵母膏0.5%、葡萄糖0.5%、NaCl 0.5%、Na2HPO4·12H2O 0.2%、瓊脂1.5%、pH 6.8，0.55×105Pa滅菌30 min。

1.1.2.4 發酵培養基（代血漿培養基）

蔗糖 130.0 g、蛋白胨 2.0 g、KH2PO40.3 g、Na2HPO41.4g、瓊脂15g、蒸餾水1.0L，pH7.0～7.2。

1.1.2.5 發酵培養基

a）脫脂牛乳培養基：采用新鮮無抗牛乳，經脫脂后加入蔗糖（12 g/L） 和植物蛋白胨（35g/L），在115℃滅菌15 min。

b） 代血漿培養基：蔗糖130.0 g、蛋白胨2.0 g、KH2PO40.3 g、Na2HPO41.4 g、瓊脂15 g、蒸餾水1.0 L，pH 7.0～7.2。

c） 改良MC培養基。

1.2 分析方法和所用儀器

1.2.1 菌種稀釋液濃度測定

用721型分光光度計在600 nm處測定稀釋后菌懸液的光密度，以同樣稀釋度進行試驗。

1.2.2 乳鏈菌肽效價測定

根據WHO規定，1 μg標準批樣商品乳鏈菌肽為1個國際單位。1 μg純乳鏈菌肽的效價為40個國際單位。測定指示菌為黃色微球菌（Micrococcus flavus） NCIB8166。

1.2.3 溶液pH值的測定

用pH M82型標準酸度計測定溶液的pH。

1.2.4 菌種活化

菌種首先在MRS培養基中，于37℃下培養24 h，并在4℃下冷藏備用。發酵試驗中菌種接種量的質量分數為2%，并按試驗要求進行培養和測定。

1.2.5 胞外多糖的分離

發酵液采用12 000 r/min（4℃） 離心30 min，取上清液加3倍體積濃度95%的冷酒精沉淀24 h，于12 000 r/min（4℃） 離心30 min，重復3次，沉淀物溶于重蒸水中，并于4℃下透析24 h。

1.2.6 分析方法

光密度采用721分光光度計測定；pH值用酸度計測定；總糖含量采用硫酸——蒽酮法測定,以葡萄糖作為標準。

1.2.7 拮抗試驗

a） 在改良 MC培養皿上，將 LA02、LA09、LA10和Leu02、Leu04、Lvan04兩兩劃十字線，看其有無拮抗性。

b）在改良MC培養皿上，加上NCIB8166指示菌，將 LA02、LA09、LA10 和 Leu02、Leu04、Lvan04兩兩劃十字線，確定其無拮抗性。

c）將無拮抗性的菌株兩兩在脫脂牛乳培養基中培養，然后將其在代血漿培養皿上分離，確定其在脫脂牛乳中無拮抗性。

2 結果與分析

2.1 10株疑似產N i si n乳酸菌株培養、篩選結果

2.1.1 產Nisin乳酸菌株篩選結果

通過試驗，確定LA02、LA09和LA10高產Nisin，其試驗結果見圖1。

圖1 LA02、LE03、LA09和LA10抑菌實驗結果

2.1.2 對LA02、LA09和LA10產Nisin的效價測定

將乳酸乳球菌LA02、LA09和LA10種子接于MRS肉湯培養基中，32℃靜止培養36 h，測定發酵液的光密度、pH值及乳鏈菌肽效價。試驗結果見表1。

表1 不同菌株發酵液的光密度、pH值及乳鏈菌肽效價

從表1的結果可知，LA02、LA09和LA10菌株高產Nisin。

2.2 10株產LAB EPS乳酸菌株培養、篩選結果

10株產LAB EPS乳酸菌株在代血漿培養基的發酵數據見表2。

表2 不同菌株的發酵數據

從表2的結果可知，Leu02、Leu04、Lvan04的LAB EPS產量較高。

2.3 共生關系

研究高產Nisin的乳酸乳球菌與高產LAB EPS乳酸菌的共生關系，結果見表3、圖2、圖3、圖4。

表3 共生實驗結果

圖2 在改良MC培養皿上的培養結果

圖3 在加有NCIB8166指示菌的改良MC培養皿上的培養結果

圖4 在脫脂牛乳培養基中培養及其分離結果

通過上面的試驗可確定高產Nisin的菌株LA02和高產EPS的菌株Lvan04可共生。

3 結論

本試驗篩選出了能夠共生的高產Nisin菌株LA02和高產EPS菌株Lvan04，為食品工業新產品的開發應用提供了依據。

［1］劉燕，李文獻，王少武.高產胞外多糖乳酸菌菌株篩選與鑒定［J］.乳業科學與技術，2009，134（1）：21-25.

［2］顧瑞霞，劉愛萍，駱承庠.不同胞外多糖產生特性的乳酸菌菌種對酸乳品質的影響［J］.乳品工業，2002，30（5）：5-7.

［3］潘道東，吳玲.高產胞外多糖（EPS）乳酸菌菌株的篩選與鑒定［J］.生物工程，2007，28（3）：171-174.

［4］李增利.NISIN的生產、提純和檢測［J］.中國食品添加劑，2004，28（4）：64-68.

Screening of lactic acid bacteria of the highest yield of nisin LAB EPS symbiotic strains

GONG Yao-zhong*WANG Cheng
（Shanxi province food quality inspection and testing center，Taiyuan 030012，China）

Three strains of lactic acid bacteria and three strains of lactic acid bacteria of the high yield of LAB EPS are screened based on 10 strains producing Nisin lactic acid bacteria strains and 10 strains of producing LAB EPS strain of lactic acid bacteria were cultured，screened and determinated.One strain with high yield of Nisin strains of lactic acid bacteria symbiotic with one strain with high yield of EPS strains of lactic acid bacteria is screened by fermentation experiment.

nisin；LAB EPS；lactic acid bacteria；symbiosis

TS252.54

A

1673-6004（2012）01-0038-03

* 弓耀忠，男，1973年出生，2007年畢業于山西醫科大學公共衛生學院，碩士，高級工程師

2011-12-07