Wnt1基因在乳腺癌細胞株MCF-7/ADR中的表達與多柔比星化療抵抗關系的研究*

張戰民，張曉華

(南昌大學第一附屬醫院腫瘤科，南昌 330006)

Wnt信號通路是一個復雜的蛋白質作用通路，其參與細胞的增殖、分化、代謝及凋亡，是細胞發育所必需的[1]，調節著細胞行為及細胞的相互作用，因此，此通路不僅在胚胎發育調控中起至關重要的作用，而且與腫瘤的發生和發展密切相關[2]。研究表明，Wnt信號通路與多種腫瘤的的生長、復發和耐藥有著密切的關系[3-4]。本研究通過沉默Wnt1基因的表達，觀察乳腺癌細胞對多柔比星敏感性的變化，為尋找克服乳腺癌耐藥性的新靶點提供依據,現將研究結果報道如下。

1 材料與方法

1.1材料 人乳腺癌MCF-7/ADR細胞株由中國醫學科學院血液學研究所提供，此細胞株的原代培養細胞供體均一，取材部位及組織類型穩定，為已鑒定細胞；PRMI 1640培養基和胎牛血清購于美國Gibco公司，四甲基偶氮唑鹽(MTT)、青霉素、鏈霉素、多柔比星為美國Sigma公司產品，總RNA提取試劑盒采用美國Promega公司產品，逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)試劑盒為日本Takara公司生產，Lipofectamine 2000轉染試劑盒購自美國Invitrogen公司，Wnt1 siRNA雙鏈干擾序列由上海吉瑪制藥技術有限公司合成。

1.2方法

1.2.1MCF-7/ADR細胞在Wnt1基因沉默前后對多柔比星耐藥性的比較

1.2.1.1MCF-7/ADR細胞的培養 采用含10％胎牛血清，100 U/mL青霉素，100 U/mL鏈霉素、RPMI 1640的完全培養基，在37 ℃、5％CO2的飽和濕度條件下培養，每2～3 d換液并傳代1次，采用0.02％乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-Na2和0.25％胰蛋白酶的1∶1混合液進行消化，且使多柔比星梯度誘導濃度最終維持在1 μg/mL。

1.2.1.2細胞總RNA的提取及光密度值的測定 培養出的MCF-7/ADR細胞每(1～5)×106個細胞加1 mL TRIzol試劑，吸管吹吸數次，15～30 ℃孵育5 min后，加0.2 mL氯仿，搖勻15 s，15～30 ℃孵育2～3 min，4 ℃離心15 min(離心半徑8 cm，12 000 r/min)。上清液移入另一EP管內，加入0.5 mL異丙醇，4 ℃離心10 min(離心半徑8 cm，12 000 r/min)，加75％乙醇1 mL，震蕩混勻，4 ℃離心5 min(離心半徑8 cm，7 500 r/min)，吸去上清液，晾干5～10 min，加入焦碳酸二乙酯(DEPC)水溶解，55～60 ℃促溶10 min。采用紫外分光光度計測定細胞總RNA在260 nm和280 nm處的吸光度(A)值，計算RNA的含量和純度。所有樣品的A260/A280均介于1.9～2.1之間，并根據260 nm吸光度定量。

1.2.1.3RT-PCR的檢測 取DEPC處理過的細胞溶液0.2 mL，加入下列反應組分：2.6 μg RNA、1 μL隨機引物(50 ng/μL)，1 μL三磷酸脫氧核糖核苷(dNTP)10 mmol，4 μL 5×RT緩沖液，1 μL高效率逆轉錄酶(日本ReverTra Ace公司)，DEPC溶液補足至20 μL，室溫放置10 min，37 ℃保溫30 min，95 ℃ 5 min使酶失活，置于4 ℃ 1～5 min，完成cDNA的合成，所得cDNA產物于-20 ℃保存。于0.2 mL PCR反應管中加入下列反應組分：2 μL cDNA、2.25 μL 10×PCR緩沖液、0.5 μL dNTP(10 mmol)、25 pmol上游Wnt1引物、25 pmol下游Wnt1引物或0.5 μL甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)引物，0.5 μL TaqDNA聚合酶，滅菌水補足至25 μL。Wnt1及β-actin的引物序列(表1)，擴增反應條件：94 ℃預變性2 min，94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，擴增30個循環；72 ℃延伸10 min，4 ℃終止反應，1.5％瓊脂糖凝膠電泳45 min。

表1 引物序列

1.2.1.4RNA干擾實驗 MCF-7/ADR細胞接種于6孔板，當細胞達到50％融合時，按照Lipofectamine 2000轉染試劑盒說明書進行基因轉染實驗。化學合成的靶向Wnt1亞基的siRNA 雙鏈干擾序列為：5′-CCU CGU CUA CUU CGA GAA ATT-3′(正義鏈)，5′-UUU CUC GAA GUA GAC GAG GT-3′(反義鏈) 。

1.2.1.5MCF-7/ADR細胞的生長抑制實驗 將MCF-7/ADR細胞分為4組，(1)對照組：細胞中只采用培養基進行培養；(2)Wnt1沉默組：MCF-7/ADR細胞加siRNA干擾處理；(3)多柔比星組：用多柔比星處理MCF-7/ADR細胞；(4)Wnt1沉默聯合多柔比星組：Wnt1沉默MCF-7/ADR后用多柔比星處理 。將細胞制成單細胞懸液，以每孔2×105個細胞接種于96孔培養板中，各組分設3個復孔，在37 ℃、5％ CO2的飽和濕度下培養24 h，細胞貼壁后加入終濃度為20 μg/mL的多柔比星，繼續培養24 h，每孔加入0.5 mg/mL MTT反應4 h，棄去培養基，加入二甲基亞砜(DMSO)100 μL，震蕩10 min，使結晶物充分溶解，實驗重復3次。選擇570 nm波長，在酶聯免疫檢測儀上測定各孔A值，計算細胞生長抑制率，比較Wnt1基因沉默前、后MCF-7/ADR細胞對多柔比星耐藥性的變化。細胞抑制率=[1-實驗組A值/對照組A值]×100％。

1.2.2免疫印跡法(Western blotting)檢測蛋白的表達 將各組細胞重懸，分別收集1×106個細胞用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌1次，離心去除上清液，加入細胞裂解液，室溫勻漿1 min，然后4 ℃離心15 min。取上清液作為樣品。5％聚丙烯酰胺凝膠上電泳分離，離心10 min(離心半徑8 cm，12 000 r/min)，上清液即為細胞總蛋白。50 μg細胞總蛋白行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，80～120 V電泳2 h，80 V轉印2 h；PBS洗膜10 min，加入包被液封閉過夜；再用PBS洗膜3次，加入 第一抗體(1∶400)和β-actin鼠抗人單克隆抗體(1∶400)，室溫孵育2 h；PBS洗膜2次，與第二抗體室溫孵育2 h；PBS洗膜2次，加入顯色液顯色15 min，顯色的硝酸纖維素膜經UPV掃描儀掃描成像。

2 結 果

2.1Wnt1基因沉默前后MCF-7/ADR細胞對多柔比星敏感性的變化 對照組、Wnt1沉默組、多柔比星組及Wnt1沉默聯合多柔比星組的細胞存活率分別為(100.0±5.2)％、(84.3±4.1)％、(68.7±4.7)％和(42.3±3.5)％，其中，Wnt1沉默組、多柔比星組及Wnt1沉默聯合多柔比星組細胞的存活率與對照組比較，差異有統計學意義(F=5.381，P<0.05)，Wnt1沉默聯合多柔比星組細胞的存活率最低。

2.2Wnt1基因沉默前后MCF-7/ADR細胞中Wnt1基因及蛋白質的表達 RT-PCR檢測結果顯示，空白對照組、脂質體對照組及陰性對照組MCF-7/ADR細胞中Wnt1 mRNA的擴增產物呈清晰條帶；用化學合成的雙鏈siRNA沉默Wnt1基因，轉染48 h后收集細胞，MCF-7/ADR細胞中Wnt1 mRNA的表達明顯下調(圖1)。Western blotting檢測上述4組Wnt1蛋白的表達情況，發現其與Wnt1基因mRNA表達的變化一致，說明siRNA轉然后抑制了Wnt1基因的轉錄過程，同時也抑制了相應蛋白的翻譯和表達，見圖1。

1：空白對照組；2：脂質體對照組；3：陰性對照組；4：Wnt1 siRNA轉染組。

3 討 論

腫瘤多藥耐藥(MDR)是臨床惡性腫瘤化療的主要障礙，也是乳腺癌患者化療失敗、復發轉移的主要原因[5]。MDR發生機制復雜，已有許多研究闡述了乳腺癌化療耐藥的機制，如P-糖蛋白(P-gp)[6]、多藥耐藥相關蛋白(MRP)[7]和乳腺癌耐藥蛋白的過表達[8]，導致腫瘤細胞內化療藥物的濃度降低以及谷膚甘膚S轉移酶(GSTS)酶性解毒作用的增強等[9]。隨著細胞技術的成熟，細胞信號通路與腫瘤多藥耐藥的關系已成為MDR機制和逆轉治療研究的新亮點。

近年來的研究表明，Wnt/β-catenin信號通路的激活，參與了腫瘤的發生及其侵襲轉移的過程，而且還與腫瘤干細胞的關系密切，是調控腫瘤干細胞增殖與分化的一個重要信號通路[10-11]。Milovanovic等[12]在研究中用原位RNA雜交法檢測了正常乳腺組織和惡性乳腺癌組織的Wnt配體Wnt1、Wnt2、Wnt4、Wnt5a、Wnt5b、Wnt6、Wnt7和Wnt10b的表達情況，發現Wnt1和Wnt6在正常和惡性組織中均強烈表達，Wnt7b在乳腺癌組織中下調。目前，認為，Wnt通路致癌的關鍵是β-catenin降解障礙致使胞漿內游離的β-catenin聚集并與Tcf/Lef結合進入細胞核，激活下游靶基因Cyclin D1、C-myc的轉錄，導致腫瘤的發生。Cyclin D1是調節細胞進入細胞周期中增生期的主要因子，已被證實為原癌基因，其過度表達和失調控均可導致細胞周期調控異常從而發生腫瘤[13-15]。鑒于Wnt1在小鼠乳腺癌中的作用和人類乳腺癌中的表達，本文檢測了Wnt1基因的mRNA在乳腺癌多藥耐藥細胞株MCF-7細胞中的表達，經RT-PCR檢測結果發現Wnt1在乳腺癌細胞呈高表達，使用化學合成的雙鏈siRNA沉默Wnt1基因，可顯著下調Wnt1 mRNA的表達，Wnt1蛋白的表達也明顯減弱，說明siRNA轉染后抑制了Wnt1基因的轉錄過程，同時也抑制了相應蛋白的翻譯和表達。本研究通過MTT試驗發現，沉默后的MCF-7/ADR細胞對多柔比星的敏感性明顯增強，表明沉默Wnt1基因可以部分逆轉MCF-7/ADR細胞對多柔比星的耐藥性。

綜上所述，Wnt1基因在乳腺癌細胞呈高表達，沉默Wnt1基因下調Wnt1基因的轉錄和翻譯，能顯著增強乳腺癌細胞對多柔比星的敏感性，部分逆轉其對多柔比星的耐藥性，說明Wnt/β-catenin信號通路可能在乳腺癌多藥耐藥中具有重要作用，為尋求克服MDR開辟了新的方向。

[1]Nusse R.Wnt signaling in disease and in development[J].Cell,2005,15(1):28-32.

[2]Santos A,Bakker AD,Zandieh-Doulabi B,et al.Pulsating fluid flow modulates gene expression of proteins involved in Wnt signaling pathways in osteocytes[J].J Orthop Res,2009,27(10):1280-1287.

[3]Fodde R,Brabletz T.Wnt/beta-catenin signaling in cancer stemness and malignant behavior[J].Curr Opin Cell Bio,2007,19(2):150-158.

[4]肖若芝，陳琰，王立琳，等．索拉非尼通過抑制WNT信號通路誘導白血病細胞株U937凋亡[J]．中國實驗血液學雜志，2011，19(2)：353-357．

[5]Putzke AP,Rothman JH.Repression of Wnt signaling by a Fer-type nonreceptor tyrosine kinase[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2010,107(37):16154-16159.

[6]Steele BM,Harper MT,Macaulay IC,et al.Canonical Wnt signaling negatively regulates platelet function[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2009,106(47):19836-19841.

[7]Watanabe K,Dai X.Winning WNT:race to Wnt signaling inhibitor[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2011,108(15):5929-5930.

[8]Cselenyi CS,Jernigan KK,Tahinci E,et al.LRP6 transduces a canonical Wnt signal independently of Axin degradation by inhibiting GSK3′s phosphorylation of beta-catenin[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2008,105(23):8032-8037.

[9]Cadigan KM,Nusse R.Wnt signaling:a common theme in animal development[J].Genes Deve,1997,11(24):3286-3305.

[10]Woodward WA,Chen MS,Behbod F,et al.WNT/beta-catenin mediates radiation resistance of mouse mammary progenitor cells[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2007,104(2):618-623.

[11]Wang YZ,Krivtsov AV,Sinha AU,et al.The Wnt/beta-catenin pathway is required for the development of leukemia stem cells in AML[J].Science,2010,327(5973):1650-1653.

[12]Milovanovic T,Planutis K,Nguyen A,et al.Expression of Wnt genes and frizzled 1 and 2 receptors in normal breast epithelium and infiltrating breast carcinoma[J].Int J Oncol,2004,25(5):1337-1342.

[13]Bala S,Peltom?ki P.CYCLIN D1 as a genetic modifier in hereditary nonpolyposis colorectal cancer[J].Cancer Res,2001,61(16):6042-6045.

[14]柳華，彭芝蘭．Wnt信號傳導通路與婦科腫瘤[J]．現代婦產科進展，2009，18(1)：60-62．

[15]Reya T,Clevers H.Wnt signalling in stem cells and cancer[J].Nature,2005,434(7035):843-850.