大腸癌中miRNA-20a的表達與TNM分期和淋巴結轉移相關性研究

馬群英，江美玲，馬鳳麗，李 釗，許岸高

(1.南方醫科大學附屬南方醫院胃腸科，廣州 510515；2.惠州市第一人民醫院/惠州市醫學研究所 516001)

大腸癌是世界上第三大腫瘤，也是導致腫瘤性死亡的第三大原因，其年新發病例大約為100萬，年病死人數超過50萬[1]。近年來，由于中國人民生活方式、飲食結構、環境因素等的改變，大腸癌的發病率及病死率呈逐年上升趨勢。因而對大腸癌發生、發展機制的進一步研究，以尋求新的診斷及治療靶標十分必要。microRNAs(miRNAs)是近年來發現的長約21～25 nt單鏈RNA，它通過與靶mRNA不完全互補配對抑制蛋白翻譯，在基因表達調控包括腫瘤形成和發展中扮演重要角色[2]，它的出現讓人們看到了大腸癌的診斷和治療的新曙光。本文通過探針法逆轉、實時定量PCR檢測52例腸癌中miRNA-20a的表達，分析其與分期及其臨床病理特征的關系。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇惠州中心醫院52例大腸癌患者外科手術切除的新鮮腸癌組織及其相應癌旁正常組織，術后經病理檢查確證。組織獲得后立即置于-80 ℃超低溫冰箱。所有患者術前均未行放、化療與免疫治療。其中，男25例，女27例；年齡28～84歲，平均59.9歲。TNM分期以美國癌癥聯合委員會(AJCC)/國際抗癌聯盟(UICC)結直腸癌TNM分期系統(第6版)為標準。

1.2方法

1.2.1主要試劑 TRIzol試劑購自Invitrogen， miRNA-20a RT Primer、miRNA-20a Real time、U6 RT Primer、U6 Real time、2×PCR TaqMan Universal PCR，TaqMan MicroRNA Reverse Transcription kit 均購自ABI公司。

1.2.2組織總RNA提取 -80 ℃超低溫冰箱保存組織(30 mg)，于冰上碾磨器磨碎，加入1 mL TRIzol試劑，按說明書操作提取總RNA,Nanodrip(ND-1000,USA) 檢測RNA溶液A260/280 nm比值及濃度，取A260/280 nm在1.8～2.1者進一步試驗。

1.2.3cDNA合成及實時定量PCR檢測 取100 ng總RNA按試劑說明書操作逆轉錄cDNA：反應條件：16 ℃ 30 min，42 ℃ 30 min，85 ℃ 5 min。然后按2×PCR TaqMan Universal PCR 試劑盒說明，以miRNA-20a 和 U6 第一鏈為模板，用miRNA-20a 和 U6 熒光探針為引物擴增。以上熒光 PCR 檢測均在ABI PRISM 7500(Applied Biosystems,USA)型熒光定量PCR儀操作完成，所有反應設立3個復孔，檢測方法為相對定量分析2-△△Ct法。

1.3統計學處理 采用SPSS13.0軟件進行統計分析。根據Q-Q圖、偏峰度計算和Kolmogorov-SmiRnov檢驗(D檢驗)推斷數據不符合正態分布，數據均采用非參數檢驗，數據以中位數(25％分位數至75％分位數)表示。配對資料采用配對資料的wilcoxon符號秩和檢驗(wilcoxonsigned-ranktest)，miRNAs與其他臨床病理資料的檢驗組間比較采用Mann-whitney檢驗，分析miRNAs與等級變量相關關系采用Jonchheere-Terpstra檢驗。以P<0．05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1miRNA-20a在腸癌組織中高表達 采用TaqMan?探針法實時定量PCR檢測miRNA-20a表達，以U6為內參，2-△△Ct法分析腸癌組織相對癌旁正常組織的相對表達量。miRNA-20a在65％(34/52)的腸癌組織中高表達；與癌旁正常組織比較，miRNA-20a在腸癌組織中的相對表達量為2.05，高于癌旁正常組織(圖1)，差異有統計學意義(Z=-3.597，P=0.000)。

圖1 miRNA-20a在大腸癌中的表達

圖2 miRNA-20a在不同TNM分期中的表達

圖3 miR-20在淋巴結陰/陽性組織中的表達

2.2miRNA-20a表達水平與TNM分期和淋巴結轉移相關 miRNA-20a的表達在TNM不同分期中表達差異有統計學意義(T=3.223,P=0.001)。隨著TNM分期越高，miRNA-20a表達越高(圖2，表1)。有淋巴結轉移腸癌組織中miRNA-20a表達明顯高于無淋巴結轉移者(Z=-2.141,P=0.037)(圖3，表1)。miRNA-20a表達和性別、年齡、腫塊位置、組織分化程度無關，見表1。

表1 大腸癌中miRNA-20a的表達與臨床病理特征的關系

1：miRNAs相對表達的中位數，括號中表示25％及75％百分位數；2：以結腸脾曲為界分為近端結腸及遠端結腸。

3 討 論

一種miRNAs可以調節多種靶基因，同一靶基因也可通過不同miRNAs調節，同時，miRNAs也可被各種調節因子所調節，miRNAs調節因子、miRNAs及其靶基因構成了錯綜復雜的基因調節網絡，而腫瘤中差異表達的miRNAs也可通過交叉的網絡促進腫瘤的發生、發展。miRNAs的發現及其研究的深入，為了解復雜的基因網絡調控機制開辟了新的領域，也為癌癥的早期篩查、診斷、治療等方面提供新的理論基礎及方法。

miRNA-20a是miRNA-17-92家族一員，其在不同腫瘤中作用不同。miRNA-20a在前列腺癌，尤其是低分化前列腺癌中表達較高[3-4]，前列腺癌細胞系過表達miRNA-20a后凋亡減少；miRNA-20a也可通過調節Fas表達增加骨肉瘤細胞轉移能力[5]；miRNA-20a還可調節淀粉樣前蛋白促進卵巢癌細胞增殖和侵襲[6]。以上研究證實miRNA-20a具有致癌作用，同時，miRNA-20a也具有抑癌作用。miRNA-20a過表達可抑制胰腺癌細胞增殖和轉移[7]；miRNA-20a在乳腺癌細胞中表達降低，可抑制細胞侵襲及轉移[8]，乳腺癌術后miRNA-20a表達下降[9]，還可通過下調Cyclin D1表達而抑制乳腺癌細胞增殖和克隆形成[10]。因而miRNAs在不同基因背景中作用不同，一種miRNA在某一癌癥中作用需結合組織表達、生存分析及細胞動物實驗等驗證，以確定其促癌或抑癌作用，從而為將來臨床治療應用等提供理論指導。

本研究證實miRNA-20a在腸癌中表達增加，與癌旁正常組織相比，差異有統計學意義(P<0.05)。有研究證實miRNA-20a在腸癌組織的高表達[11-13]，與本研究結果一致。同時，本研究結果表明腸癌組織中miRNA-20a還與TNM分期和淋巴結轉移相關，說明miRNA-20a可能參與調節大腸癌轉移過程。且有文獻報道miRNA-20a高表達與生存期降低有關[14]；敲低SW620細胞中miRNA-20a可增加化療敏感性，而過表達SW480中miRNA-20a可導致化療抵抗[15]。可見，miRNA-20a在大腸癌中的作用文獻報道趨于一致，即miRNA-20a在大腸癌中高表達，與患者生存期及化療抵抗有關，在大腸癌中可能具有促癌作用。

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