CD147超表達對γ分泌酶影響的臨床研究*

張錦巍,井麗娟,孫亞平，李 聰，董貴成

(內蒙古科技大學包頭師范學院,內蒙古包頭 014030)

阿爾茨海默病(Alzheimer′s disease,AD)是神經系統進行性退行性疾病，臨床特征表現為高級認知功能、記憶功能障礙和行為異常等[1]。主要病理改變包括大腦皮層和海馬區胞外老年斑沉積和胞內神經纖維纏結，老年斑塊的主要成分是淀粉樣蛋白Aβ40和Aβ42[2-4]。γ分泌酶切割底物C99生成強自聚性的Aβ，γ分泌酶是產生Aβ的最后一步也是限速步驟。因此，研究γ分泌酶的活性調控因子,對于尋找AD的治療藥物有一定指導和借鑒意義。

γ分泌酶由PS、NCT、APH及Pen2四大核心部分組成的具有復雜空間結構和一定活性中心的復合物[3-7]，主要參與APP和Notch等重要跨膜蛋白的切割.可切割APP經β-分泌酶切割的產物C99而生成多種Aβ[8]。

CD147是一種高度糖基化的球蛋白，編碼基因位于人19號染色體編碼269個氨基酸[9]。 CD147在體內分布廣泛， 同時表現為高糖型CD147[相對分子質量為(40～66)×103]和低糖型CD147[相對分子質量為33×103]。本文通過CD147 cDNA轉染MEF(KO),以研究其對γ分泌酶活性的影響。

1 材料與方法

1.1材料 MEF(KO)由康斯坦茨大學提供、FBS、MEF、脂質體轉染培養基、G148、CD147 cDNA、胰酶、混合型酶抑制劑、CHAPSO、預清潔ProteinG Beads、載有PS-1抗體的ProteinA Beads、 CD147一抗、CD147二抗、PVDF膜、ECL試劑、底物C99、Aβpeptide40與 Aβ42的酶聯免疫吸附測定(ELISA)反應試劑盒、CO2培養箱、轉膜儀、顯微鏡等。

1.2方法

1.2.1選擇生長活力強的細胞 將MEF(KO)在 100 mm×20 mm的平板上培養成為幾個梯度。選擇36 h內覆蓋率達70％～90％的進行下一步實驗。

1.2.2CD147 cDNA轉染 (1)吸取CD147 cDNA 25 μg加入到1 mL OPTI-MEM 低血清培養基混勻，記做A,室溫靜置10 min。(2)吸取脂質體60 μL加入到1 mL OPTI-MEM 低血清培養基混勻,記作B，室溫下靜置10 min。(3)將上述A、B溶液混合均勻，室溫靜置15 min。(4)吸出 MEF(KO)細胞培養平板的MEF，用未加抗菌藥物的選擇培養基洗滌3次。(5)將A、B混合溶液加入覆蓋80％～90％的平板并再加8 mL選擇培養基。(6)培養12 h以后換成不含抗生素含10％FBS的MEF。(7)培養36 h后將1個平板的細胞分成2個平板進行培養。(8)培養72 h后可進行第2次轉染,方法同上。(9)96 h后收集經過CD147 cDNA轉染的細胞。(10)轉染后的細胞進行蛋白質免疫印跡法(Western blotting)檢測。

1.2.3G418篩選CD147超表達轉染細胞 配制梯度濃度分別為150、300、600、1 200 mg/mL,以確定G418的最佳篩選濃度。將CD147 cDNA轉染后的細胞接種到含G418的培養基中,24 h后吸出上浮死掉的細胞,并再次更換培養,10～15 d后將細胞移至96孔板擴大培養。15 d后用胰蛋白酶溶解處理細胞,移至皿中培養,并加入含G418的培養液,10 d后收集細胞,用于Western blotting,以篩選CD147最高表達的細胞。

表1 CD147的表達量

表2 Aβ40和Aβ42的生成量總含量

1.2.4收集細胞并分離純化蛋白 處理實驗組(E)和對照組(C)細胞,并收集純化含γ分泌酶的樣本:(1)細胞破碎制備全蛋白C1和E1;(2)加入CHAPSO徹底溶解后,超速離心制備C2和E2;(3)用PS-1抗體純化C2或E2制備IPC2和IPE2。實驗步驟:將E組和C組的細胞分別收集到2 mL的離心管,用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3次,13 000 r/min 4 ℃離心2 min去液。加入0.5 mL勻漿緩沖液后,用細胞破碎針頭破碎40～50次,3 000 r/min離心5 min.取0.5 mL上清液,加入0.5 mL勻漿緩沖液,再破碎一次,保留上清液1 mL,分別取上清液0.2 mL,記為E1或C1,加入CHAPSO的Hepes buffer備用，將剩余上清液0.8 mL移入超速離心管,50 000 r/min離心60 min,以沉淀蛋白,加入含1％CHAPSO的Hepes buffer 0.2 mL?；旌衔镉?℃ 空搖90 min,35 000 r/min離心30 min,取0.2 mL上清液,分別記為E2或C2。在所剩0.8 mL上清液中,加入30 μL ProteinG Beads,經4 ℃搖動90 min,然后13 000 r/min離心2 min,以棄除ProteinG Beads。上清液中加入2 μL PS1抗體與30 μL ProteinA Beads,置于垂直混合旋轉器上于4 ℃放置24 h經13 000 r/min離心2 min得ProteinA Beads,用含CHAPSO的Hepes buffer清洗4次。吸附在ProteinA Beads上的蛋白即為γ分泌酶復合物,分別記為IPC2和IPE2。Western blotting 分析C1、E1、C2、E2、IPC2、IPE2中CD147的量。

1.2.5ELISA分析樣品C1、E1、C2、E2、IPC2及IPE2中γ分泌酶復合物活性 取上述樣本E1、C1、E2或C2 0.1 mL(蛋白濃度1.5 mg/mL)，加入3 μL底物C99(終濃度0.5 μmoL)，于37 ℃反應7 h。將100 μL含 CHAPSO的Hepes buffer，3 μL C99加入IPE2和IPC2中于37 ℃進行同樣反應7 h。將上述反應液50 μL以及Aβ40與 Aβ42的標準品分別加酶標板中，加一抗50 μL于37 ℃孵育4 h。將上清液吸出，洗脫3次后，加入已配好的二抗稀釋液150 μL 37 ℃反應60 min。再一次將上清液吸出，洗脫4次。然后加入穩定發色液150 μL 37 ℃放置60 min，加入等量的終止液?；靹蚝鬁y產物。

2 結 果

2.1Western blotting分析CD147表達量 實驗組E1、E2及IPE2中CD147表達量較相應對照組樣本C1、C2和IPC2分別上升(11±5.5)％,差異無統計學意義(P=0.08),上升(28.2±9.1)％,差異有統計學意義(P<0.01)及上升(50.0±9.8)％,差異有統計學意義(P<0.002),見表1。

2.2ELISA分析Aβ40和Aβ42的生成量 實驗組所得E1、E2及IPE2與飽和濃度底物C99反應生成的Aβ40和Aβ42總量均明顯低于同樣方法從對照組細胞制備所得樣本C1、C2及IPC2。參照樣本C1、C2及IPC2，經CD147轉染，樣本E1、E2及IPE2 中所含γ分泌酶活性分別降低(61.8±3)％，差異無統計學意義(P=0.25)，降低(82.9±5)％，差異有統計學意義(P<0.001)，降低(190±7)％，差異有統計學意義(P<0.001)。比較對照組樣本C1、C2及IPC2，在相同的條件下，樣本IPE2催化生成的短肽Aβ40和Aβ42含量最低，見表2。

2.3經CD147超表達處理后MEF(KO)中CD147表達情況 見圖1。

圖1 CD147超表達后蛋白質Western blotting分析結果

圖2 C1和E1中CD147蛋白質含量的Western blotting分析結果

2.4C1、C2和E1、E2中CD147蛋白質含量的Western blotting分析結果 CD147 cDNA超表達后實驗組CD147表達量增加，見圖2、3。

2.5IPC2和IPE2中CD147蛋白質含量的Western blotting分析結果 C2與E2經PS-1特異性抗體免疫沉淀所得IPC2和IPE2，γ分泌酶復合物得到進一步純化，見圖4。

2.6ELISA檢測樣本中所含γ分泌酶活性 隨著CD147的表達的進一步增加，Aβ的表達量減少，可知γ分泌酶活性隨CD147表達量增高而負增長，見圖5。

圖3 C2和E2中CD147蛋白質含量的Western blotting分析結果

圖4 IPC2和IPE2中CD147蛋白質含量的Western blotting分析結果

圖5 ELISA檢測樣本(C1、E1、C2、E2、IPC2和IPE2)中所含γ分泌酶活性

3 討 論

由于γ分泌酶切割C99是生成Aβ的最后一步也是限速步驟[10]，所以近期對γ分泌酶抑制劑的研究一直是個熱點，同時也是個難點。突出表現為抑制劑選擇性差。首先，淀粉斑塊是以Aβ42為核心，周圍聚集Aβ40。Aβ42極難溶解，但占Aβ的比例很小，而Aβ40是可溶的且還有其他未知的作用[11-12]。而選擇性差的抑制劑對于抑制Aβ40的生成作用強于Aβ42。其次，γ分泌酶在作用APP的同時也作用其他神經遞質，一旦生成或分解受阻，就會引起神經系統中毒，其不良反應遠遠大于預期結果。 現階段，γ-分泌酶抑制劑主要包括抑制γ分泌酶酶解APP和抑制PS蛋白酶，實際上只是當作工具藥來研究酶本身的結構和功能[13]。選擇性、穩定性、血腦屏障的穿越和細胞攝取等，都是研究抑制劑所必須考慮的。

既然Aβ42占Aβ總量的比例很小，只要使γ分泌酶的活性降低一定的值，就能相對減少Aβ42的生成量，達到理想的效果。如果抑制劑本身就是γ分泌酶復合體的組成成分且能調控γ分泌酶的活性，以上的一切問題就迎刃而解了。

研究證明蛋白CD147能夠調節導致淀粉體斑塊的產生[14-15]。利用靶向的RNA沉默細胞中的CD147，而γ分泌酶的組成亞基以及淀粉樣前體蛋白都不受這種沉默的影響。當CD147被沉默時，Aβ的產量顯著增加了。

本實驗通過第一步Western blotting檢測CD147蛋白的表達量，證明超表達細胞模型構建成功。第二步的數據顯示超表達細胞模型可穩定、高效的表達目的蛋白。第三步CHAPSO溶解膜蛋白復合物、超速離心使CD147得到了純化，證明CD147和跨膜蛋白結合緊密。特異性PS1抗體沉淀，使樣品進一步純化，說明CD147可能是γ分泌酶的調控亞基。為進一步研究其對γ分泌酶活性的影響奠定了基礎。

ELISA分析表明，隨著CD147的表達量增高，Aβ40和Aβ42的產量下降，證明CD147是γ分泌酶的負調控因子。

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