IgA腎病患者腎組織內synaptopodin的表達及意義*

陳道軍,吳 明,詹 鋒,林書典,符克英,韓 輝

(海南省人民醫院，海口 570311)

IgA腎病(IgAN)是一種多病因引起的以腎小球系膜區IgA沉積為主的系膜增生性腎小球腎炎，已成為全球最常見的原發性腎小球疾病[1]。臨床和病理表現多樣化，個體預后差異懸殊，10%～20%的成年患者在10年內可進展為終末期腎臟病[2]。迄今為止尚無一種分型能準確地反映患者的臨床實際情況，各個分型之間也很難達成一致。尋找腎臟病理組織中新的生物標志物以期預測IgAN病情的進展和預后，指導臨床治療將成為此研究的目的。作者選取在本院經腎活檢明確診斷為IgAN患者的腎活檢組織標本作為研究對象，應用間接免疫熒光技術，觀察synaptopodin在IgAN患者腎組織中的表達，并探討其在腎組織分布特征、進行相關分析，推測病情預后。

1 資料與方法

1.1一般資料 回顧分析2003年6月至2009年9月在本院經腎活檢明確診斷為IgAN患者的202例腎活檢組織標本，所有病例由一位高級職稱病理醫師獨立閱片。所有標本已經過苦味酸液固定、石蠟包埋，2 μm厚度切片，均行蘇木素伊紅染色(HE)、過碘酸雪夫反應(PAS)、六胺銀染色(PASM)和馬松三色染色(Masson)，結合IgA等免疫熒光檢測后已確診為IgAN，所有染色標本均在冰箱中存放。復習病歷，排除狼瘡性腎炎、紫癜性腎炎及慢性肝病等繼發性IgAN病例。所有病例在當初確診時已按Lee分級系統[3-5]分為Ⅰ～Ⅴ級(分類)，按分層抽樣的原則，用隨機號碼表抽取樣本，從各級中分別隨機選取10例標本。分5組，總共標本為50例。

1.2方法

1.2.1資料分析 對選取50例樣本，從冰箱中調出已染色的病理標本，重新通過光鏡觀察，參照Katafuchi積分方法[6]，依據病變程度進行積分。

1.2.2間接免疫熒光染色 從冰箱中調取出已選定的石蠟包塊，脫蠟、水洗、熱修復抗原、加一抗(Mouse Anti-IgG Synaptopodin)4 ℃ 過夜。PBS(pH7.2～7.6)洗滌2 min×3次。滴加二抗(1∶40稀釋)，FITC標記的兔抗小鼠IgG,37 ℃30 min。PBS(pH7.2～7.6)洗滌2 min×3次。

1.2.3每份腎臟病理組織同時行陰性對照。

1.2.4熒光顯微鏡觀察結果。

1.2.5分析

1.2.5.1熒光圖片拍照 用免疫熒光顯微鏡觀察(×200)。把樣品放到載物臺上，快速選擇視野，每視野有一個完整的腎小球，選擇5個視野，立即拍照，在拍攝熒光照片時，確保每張照片的拍攝條件完全一致。

1.2.5.2圖片分析 對所得的照片用Imagerpro6.0圖像分析軟件進行定量分析腎組織中synaptopodin的表達情況，測量每個腎小球截面總的積分光密度值(IOD SUM)及所測腎小球截面的面積(area SUM)，計算出平均光密度值[mean density=(IOD SUM)/(area sum)][7-8]。每例腎組織mean density由5個視野的相片經圖像分析后取平均值。

1.3主要試劑及來源 synaptopodin 一抗(Mouse Anti-IgG Synaptopodin)購自美國Fitzgerald Industries International公司。二抗(1∶40稀釋)，FITC標記的兔抗小鼠IgG 購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.4統計學處理 數據結果計量資料列表來顯示，因所有的病例按Lee分級分為Ⅰ～Ⅴ級為多個獨立樣本的等級計量資料，所以，5組腎組織中Synaptopodin所表達的平均光密度值、Katafuchi積分進行組間比較將采取Kruskal-Wallis H 檢驗，通過觀察平均秩次(mean rank)來判斷組間數據變化。對synaptopodin所表達的平均光密度值與Katafuchi積分進行相關分析。采用SPSS16.0軟件進行分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1腎組織中synaptopodin所表達的平均光密度值、Katafuchi積分進行組間比較 各組的平均光密度值見表1，經Kruskal-Wallis H 檢驗，從Ⅰ～Ⅴ級的平均秩次分別為44.30、35.30、26.15、16.25、5.50，H值為44.026，P<0.01；可認為5組的平均光密度值有差異，可看出隨著病情的加重，synaptopodin的表達逐漸減少，見表2。

表1 各組間synaptopodin所表達的平均光密度值

5組樣本通過光鏡觀察，參照Katafuchi積分方法，依據病變程度進行積分，經Kruskal-Wallis H 檢驗結果：從Ⅰ～Ⅴ級的平均秩次分別為7.00、16.60、23.80、34.60、45.50，H值為42.983，P<0.01；可認為5組的Katafuchi積分值有差異，可看出隨著病情的加重，Katafuchi積分值遂漸增大，見表2。

表2 平均光密度及Katafuchi積分的各組平均秩次

2.2所有選取病例的腎臟組織中平均光密度值與Katafuchi 病理評分值間的相關性分析 通過統計學的Spearman相關分析，r=-0.992，P<0.01，故認為所有選取的病例，腎臟組織中synaptopodin蛋白所表達的平均光密度值與Katafuchi 病理評分值之間呈負的直線相關。

圖1 所有病例的平均光密度與Katafuchi積分

3 討 論

Barisoni等[9]報道了synaptopodin在局灶性節段性腎小球硬化(FSGS)和HIV相關性腎病表達下調，而在正常兒童與MCD患者間無差別。Kemeny等[10]觀察到在原發性FSGS早期階段synaptopodin即消失。楊琪等[8]研究發現，synaptopodin表達從健康人、微小病變腎病(MCD)、IgAN、系膜增殖性腎炎(MsPGN)到局灶節段性FSGS依次下降，由此推斷它的變化影響足細胞的結構和功能，對腎小球疾病的進展有重要作用。但是，對于synaptopodin的表達，目前，尚無關于IgAN病程的研究，synaptopodin能否作為反應IgAN病理程度的一項指標，本實驗給予了解答。

本研究發現，synaptopodin沿腎小球毛細血管袢呈顆粒狀、線狀表達，在硬化區無表達；從表1經統計分析后可見從Ⅰ～Ⅴ級5組的IgAN患者，腎組織中synaptopodin所表達的平均光密度逐漸減少，也提示了IgAN患者腎組織中synaptopodin所表達的平均光密度值與Lee分級一樣可以反應病情的嚴重程度，隨著病情的加重，synaptopodin的表達逐漸減少。Katafuchi積分法[6]也可以反應出IgAN病情的變化，從表2經統計分析后可見，本實驗結果也符合此變化，隨著病情的加重，Katafuchi積分的分值也逐漸增加。從圖1中可見，IgAN病程中腎組織內synaptopodin所表達的平均光密度與Katafuchi積分呈反向相關。

足細胞是維持腎小球濾過膜結構和功能正常的主要細胞之一。而足細胞特殊結構的維持主要依賴于以肌動蛋白為主的細胞骨架系統和足細胞中表達的特異性蛋白分子。足細胞減少是疾病活動性的重要標志[11]。Mundel和Stuart[12]總結了各種因素引起足細胞損傷的原因：(1)裂孔隔膜復合物及脂筏的異常；(2)GBM或足細胞-GBM相互作用的影響；(3)肌動蛋白細胞骨架及其與α-actinin-4的聯系破壞；(4)足細胞喪失其表面的電荷屏障。而在actin細胞骨架相關蛋白中有一種由YNPO基因編碼synaptopodin，該基因含3個外顯子。synaptopodin是一種與肌動蛋白微絲緊密相連的富含脯氨酸的線狀蛋白。足細胞的結構和功能之間有著密切的因果聯系，足細胞具有對抗腎小囊內張力的結構基礎。synaptopodin和α-actinin-4可以與足細胞表達的緊密連接蛋白MAGI-1相互作用而與肌動蛋白骨架連接[13]，其基因的突變或缺失可以導致足細胞結構的改變，引起蛋白尿和腎小球硬化的發生。足細胞的再生能力有限，當足細胞損傷時，足細胞只能通過有限的增生能力代償缺失的足細胞。當損傷進一步加重時，足細胞從腎小球基底膜上剝脫的速度超出了足細胞的代償能力，使腎小球基底膜部分區域裸露，腎小球濾過膜的完整性遭到破壞。足細胞損傷后數量減少將導致腎小球硬化[14]。

在IgAN腎小球固有細胞的研究方面，以往人們重點關注在系膜細胞的病變，目前，越來越多的腎臟病學者對腎小球足細胞在腎病中的變化及意義進行深入研究。Gagliardini和Benigni[15]發現IgAN的nephrin、podocin、podoplaninm表達減少。IgAN是一組臨床綜合征，臨床表現為腎病綜合征樣改變，病理上也可表現有新月體腎炎或硬化性腎炎，臨床表現多樣性。Habib等[16]研究顯示，IgAN時蛋白尿多少是影響預后的重要因素，無蛋白尿的患者預后良好。由于發病機制尚未完全闡明，目前，缺乏病因性治療手段，IgAN治療現狀并不令人滿意。很多研究都致力于尋找與預后或治療相關的組織學危險因素。腎臟病理表現則能夠提供更多的信息。除了較為公認的Haas和Lee分級系統，Katafuchi積分法[6]及其他多種半定量評分系統也得到了越來越多的應用。然而，迄今為止尚無一種分型能準確地反映患者的臨床實際情況，各個分型之間也很難達成一致。傳統的Lee分級或Katafuchi積分存在有較大的人為主觀因素，不利于病情精確的評估及預測，特別是對于個體患者更不利于療效的觀察。

對于一些局灶節段性增生硬化型IgAN，其非硬化腎小球的病理形態呈輕微病理改變，傳統的Lee分級或Katafuchi積分更不能反映病情的嚴重程度，診斷時可能均被列為Ⅰ級IgAN或Katafuchi積分較低，但局灶節段性增生硬化型IgAN預后并不樂觀，甚至臨床上可表現為大量蛋白尿。Yang等[17]對MCD患兒18例，DMH患兒7例，FSGS患者13例和正常兒童7例的腎組織進行免疫組化分析，并且用計算機圖像分析法作定量研究，得出以下結論：從MCD到FSGS，snaptopodin的表達依次減少，尤其在MCD和FSGS之間synaptopodin的表達存在顯著差異。可見，腎組織中synaptopodin的定量分析可對局灶節段性增生硬化型IgAN進行區分，synaptopodin所表達的平均光密度值的變化，可反應出IgAN病情。

通過熒光顯微鏡對腎組織中synaptopodin的觀察并采用圖像分析軟件對其進行具體的量化評估。synaptopodin所表達的平均光密度值更能具體及客觀地判斷IgAN病情的變化及評估預后，同時可以觀察療效。也為IgAN的研究提供一種新的指標。

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