白介素-23R基因多態性與肝癌易感性研究*

覃彥平，秦 雪

(1.廣西壯族自治區柳州市紅十字會醫院檢驗科 545001;2.廣西醫科大學，南寧 530021;3.廣西醫科大學第一附屬醫院臨床實驗中心，南寧 530021)

肝癌是人類最常見的消化系統惡性腫瘤之一，全世界每年新發肝癌患者約60萬人，位居惡性腫瘤的第5位。中國發病人數約占全球的50%以上，全球 55%肝癌病例發生在中國[1]。研究證實白介素-23R(IL-23R)基因的某些多態性位點與胃癌、卵巢癌、食管癌等有關[2-4]。但IL-23R基因多態性與肝癌的遺傳易感性的關系尚不清楚。本研究對IL-23R基因rs10889677A/C、rs1884444G/T兩個位點單核苷酸多態性(SNP)進行檢測，以探討這兩個位點與肝癌的遺傳易感相關性的關系。

1 資料與方法

1.1一般資料 實驗分肝癌組和對照組2組，肝癌組84例，為2010年6～10月在廣西醫科大學第一附屬醫院因肝癌住院，未經化療、放療的患者，其中男73 例，女11 例，年齡21～69歲，中位年齡47.5 歲，HBsAg陽性84 例(100%)，AFP陽性55 例(65.5%)，肝功能ALT平均值為152.1 U/L，全部病例均經臨床和病理檢查確診為肝癌。對照組94例，為同期健康體檢者，其中男74 例，女21 例，年齡21～69歲，中位年齡44.5 歲，所有對照組體檢結論為健康合格者。所有研究對象和實驗標本的獲得均符合倫理學原則。

1.2DNA標本 所有未經化療、放療的肝癌組患者和健康對照者均抽取外周靜脈血5 mL,EDTA抗凝，采用苯酚-氯仿法提取外周血白細胞基因組DNA，置于-20 ℃冰箱備測。

1.3引物設計 IL-23R基因的rs10889677、rs1884444兩個基因序列PCR擴增引物參照文獻設計[5-6]。引物由上海生工生物有限公司合成，引物序列見表1。

表1 引物序列

1.4聚合酶鏈反應 采用DA-7300PCR反應儀，試劑購自Fermentas公司。PCR反應體系為25 μL，包括基因組DNA 2.0 μL，上下游引物(1 μmol/L)各1 μL，Dream TaqTM Green PCR Master Mix(2x)12.5 μL,不足體積用滅菌去離子水補充至25 μL。IL-23R基因rs10889677位點的PCR反應循環參數為：94 ℃預變性2 min,94 ℃變性30 s,62.8 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,36個循環；72 ℃延伸10 min。IL-23R基因rs1884444位點的PCR反應循環參數除退火溫度為56 ℃外，其他反應條件同rs10889677。取產物5 μL經含有EB的2%瓊脂糖凝膠電泳，觀察PCR擴增是否成功。

1.5擴增產物的限制性酶切 酶切反應體系均為20 μL，包括PCR產物10 μL，限制性內切酶(10 U/μL)1μL，反應緩沖液2 μL，滅菌去離子水補充至20 μL,37 ℃酶切過夜。其中rs10889677位點的限制性內切酶為Mnll,rs18844444位點則為HeaⅢ(限制性內切酶均購自Fermentas公司)。酶切產物與標準 DNA marker同步電泳(含EB的3%瓊脂糖凝膠電泳)，觀察基因型。

1.6基因型判斷 (1) IL-23R基因rs10889677位點。CC基因型：完全切開，酶切產物有154 bp和62 bp兩條帶；CA基因型：未完全切開，酶切產物有216、154和62 bp 3條帶；AA基因型：不能切開，酶切產物只有216 bp 1條帶。(2) IL-23R基因rs18844444位點。GG基因型：完全切開，酶切產物有117 bp和19 bp兩條帶；GT基因型：未完全切開，酶切產物有136、117和 19 bp(片段太小，電泳不可見)3條帶；TT基因型：不能切開，酶切產物只有136 bp 1條帶。

M:對照組;9：CA基因型；5、6：CC基因型；1、2、4、7、8、10：AA基因型。

1.7測序鑒定 隨機抽取10%的樣本送至上海生工生物有限公司進行測序。測序儀器為ABI-PRISM3730。

1.8統計學處理 對照組和肝癌組經Hardy-Weinberg平衡檢驗分析后，采用直接計數計算基因型和等位基因頻率；各組間等位基因頻率和基因型分布頻率差異采用χ2檢驗和危險性分析，計算比值比(OR)和95%可信區間(95%CI)。采用PLINK軟件構建IL-23R基因rs1884444和rs10889677兩個位點的單倍型并進行分析。

2 結 果

2.1IL-23R基因rs10889677、rs1884444位點酶切結果和測序結果 限制性內切酶產物經電泳分析后發現IL-23R基因rs10889677、rs1884444酶切后均可產生3種基因型，見圖1、圖2。測序結果和酶切結果均吻合。

2.2Hardy-Weinberg平衡檢驗 經Hardy-Weinberg平衡檢驗IL-23R基因rs10889677、rs1884444位點對照組和肝癌組基因型實際值與預測值比較結果P值分別為0.775、0.387，P>0.05，均符合Hardy-Weinberg平衡，顯示本研究所檢測樣品具有代表性和可比性。

2.3IL-23R基因rs10889677、rs1884444位點肝癌組和對照組基因型及等位基因型分布比較 見表2。

表2 IL-23R基因rs10889677、rs1884444位點基因型、等位基因型在肝癌組和對照組中的分布[n(%)]

由表2可見肝癌組與對照組比較，IL-23R基因rs10889677位點AA、AC、CC基因型及A、C等位基因型分布比較差異無統計學意義(P>0.05)。IL-23R基因rs1884444位點TT、TG、GG基因型及T、G等位基因型分布比較差異有統計學意義(P<0.05)。顯示IL-23R基因rs1884444基因多態性與肝癌的遺傳易感性有關。危險分析顯示T等位基因型與G等位基因型相比其OR值為1.636，95%CI為1.027～2.607，提示攜帶T等位基因型的個體較攜帶G等位基因型者發生肝癌的風險增加1.636倍。

2.4IL-23R基因rs10889677、rs1884444位點單倍型分析 采用PLINK軟件對rs1884444和rs108896772兩個位點進行單倍型構建，共構建出4種單倍型。由表4可見GA單倍型與肝癌的患病風險性有相關性(P=0.020 9),攜帶 GA單倍型的個體患肝癌的風險增加至1.72。其他單倍型與肝癌的患病風險性無相關性(P>0.05)。

表3 IL-23R基因rs10889677、rs1884444位點單倍型在肝癌組和對照組中的分布

3 討 論

經研究發現已有多種炎性細胞因子介導的信號通路參與肝癌的發生、發展[5]。IL-23是一種與腫瘤有關的炎癥性細胞因子[6]。IL-23R是IL-23受體復合物的2個亞基之一，主要的生物學作用是介導IL-23在細胞內的信號傳導。IL-23需通過與其相應的IL-23受體復合物結合才能發揮其生物學功能。當IL-23與IL-23R結合后，可引發下游信號通路Jak2、Tyk2分子的激活，磷酸化受體胞內區的Stats結合位點，使Stats分子以二聚體方式聚集，磷酸化的Stats二聚體入核后，激活靶基因的轉錄。IL-23與IL-23R還能誘導記憶性CD4+T細胞向TH17細胞分化[7]。TH17細胞可高表達IL-17，并分泌大量促炎因子如：IL-6和TNF-α等[8]。TH17細胞可介導炎性反應、自身免疫性疾病、腫瘤等疾病的發生、發展[9]。而致炎細胞因子IL-17可以促進多種細胞亞群及巨噬細胞產生TNF、IL-8等促炎細胞因子，引起細胞浸潤和組織破壞[10]。上述炎癥因子構成了IL-23/IL-23R/TH17/IL-17通路，該通路是引起機體炎癥及免疫紊亂的重要組成部分。由于腫瘤可源自慢性炎癥[11]，Kuang等[12]揭示腫瘤可激活單核細胞分泌IL-23等細胞因子，觸發TH17細胞分化和增殖；TH17細胞分泌的IL-17累積在肝癌中通過引起血管生成而促進疾病的進展。而作為IL-23/IL-23R/TH17/IL-17通路信號傳遞因子的IL-23R也極有可能與肝細胞癌變有關。本研究首次探討了IL-23R rs10889677A/C及IL-23 R rs1884444G/T兩個位點多態性與肝癌的關系。本研究結果顯示IL-23R基因rs1884444位點基因型、等位基因型分布頻率差異有統計學意義(P<0.05)。危險分析顯示攜帶T等位基因型的個體較攜帶G等位基因型者發生肝癌的風險高。各單倍型中只有GA單倍型與肝癌的患病風險性有相關性(P=0.020 9)。說明了IL-23R基因rs1884444位點基因多態性可能與肝癌遺傳易感性有關。而IL-23R基因rs10889677位點基因型、等位基因型分布頻率差異無統計學意義(P>0.05)。該位點與肝癌的遺傳易感性無明顯相關性。

本研究的IL-23R rs10889677A/C及IL-23R rs1884444G/T兩個位點均為Haploview上的標簽SNP，分別位于外顯子11和外顯子2，二者都是由于堿基的取代而出現SNP(rs1884444是T→G，rs10889677是A→C)。基因序列中單個核苷酸的替代、插入或缺失，都會引起編碼氨基酸的改變或導致轉錄的mRNA剪接的改變，影響基因表達與蛋白質的功能，從而導致疾病的發生。IL-23R基因多態性與食管癌、胃癌等的研究已證實IL-23R可能與某些炎癥相關的腫瘤易感性有關。Zhang等[13]研究發現，IL-23R可通過交替剪接產生剪接異構體，并優先在肺癌中表達，進而推測該表達可能有助于細胞逃避機體的免疫監視或攻擊，使IL-23R可能在某些癌癥的發生、發展過程中發揮作用。Chen和Hsich[14]證實，IL-23R信號通路中的Stats3調控多種與細胞增殖及凋亡有關的功能蛋白的表達，Stats3的異常活化是引起子宮內膜癌的原因之一。本研究顯示，與肝癌遺傳易感性相關的IL-23R rs1884444基因位于外顯子2，后者負責編碼IL-23R的信號肽[15]，信號肽的功能是決定新生肽鏈在細胞中的定位或決定某些氨基酸殘基修飾。雖然rs1884444已被報道與胃癌及食管癌等的遺傳易感性相關，但rs1884444的功能目前還不明確，有待于進一步的功能學研究。

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