血紅素氧合酶-1對大鼠腦外傷后細(xì)胞凋亡的影響

劉中洪，馮家龍，蔣 濤，冉春雷

(武警重慶市總隊醫(yī)院神經(jīng)外科，重慶 400061)

創(chuàng)傷性腦損傷(traumatic brain injury,TBI)對神經(jīng)細(xì)胞的損傷分原發(fā)性和繼發(fā)性兩種，細(xì)胞凋亡是繼發(fā)性損傷的一種重要細(xì)胞死亡方式，它是由一系列基因控制的遲發(fā)性神經(jīng)元死亡，對繼發(fā)性腦損傷起著重要的作用，并直接影響TBI的預(yù)后。血紅素氧合酶-1(heme oxygenase-1,HO-1)是血紅素代謝的一個關(guān)鍵酶及限速酶，具有抗炎、抗氧化、抗凋亡及神經(jīng)保護(hù)作用。為深入研究HO-1對腦外傷后腦組織的保護(hù)作用，本實驗觀察大鼠腦外傷HO-1對神經(jīng)細(xì)胞凋亡是否有抑制作用，以期為臨床顱腦外傷開辟新的治療途徑。

1 材料與方法

1.1材料 血晶素(hemin)、鋅原卟啉(ZnPP)購自Sigma公司，牙托粉、牙托水、多聚甲醛等常規(guī)試劑購自重慶試劑公司，兔抗HO-1(1抗)、抗凋亡蛋白(Bcl-2)(1抗)、ABC試劑盒均購自南京博士德生物公司。TUNEL法凋亡檢測試劑盒購于Boehringer公司，液壓傷模型采用Dixon裝置。

1.2方法

1.2.1復(fù)制動物模型及取材 實驗動物及分組：72只雄性SD大鼠購自第三軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心，體質(zhì)量280～300 g，采用隨機數(shù)字表完全隨機分為血晶素組、生理鹽水組和鋅原卟啉組各24只，然后再將每組動物又隨機分為灌注組和非灌注組。采用液壓傷復(fù)制腦外傷動物模型，動物致傷后按45 mg/100 mg體質(zhì)量腹腔注射血晶素，生理鹽水和鋅原卟啉按同樣量注射。傷后每天注射1次，喂養(yǎng)72 h后處死。切取以損傷灶為中心前后5 mm的大腦冠狀切面，固定24 h后，做冰凍切片行SP免疫組織化學(xué)及TUNEL染色。

1.2.2腦組織免疫組織化學(xué)檢測HO-1和Bcl-2的表達(dá) 灌注組取標(biāo)本前進(jìn)行腦灌注固定，斷頭取腦組織，繼續(xù)在4%多聚甲醛中固定6 h以上。然后在30%的蔗糖多聚甲醛液里脫水。作冰凍切片進(jìn)行免疫組織化學(xué)觀察HO-1和Bcl-2的表達(dá)情況，具體操作按試劑盒說明進(jìn)行。每只動物觀察受傷周圍5個視野，計數(shù)陽性細(xì)胞，然后求平均值，作為每個動物的HO-1和Bcl-2陽性細(xì)胞數(shù)。

1.2.3神經(jīng)細(xì)胞凋亡檢測 按照TUNEL凋亡細(xì)胞檢測試劑盒說明書操作。細(xì)胞核中有綠色熒光者為陽性細(xì)胞，即凋亡細(xì)胞，每組選5張切片，每張切片在腦損傷側(cè)皮層計數(shù)5個不重疊視野，計數(shù)100個神經(jīng)細(xì)胞中的凋亡細(xì)胞，取平均值，為該切片凋亡指數(shù)。

2 結(jié) 果

2.1HO-1、Bcl-2的表達(dá)和凋亡指數(shù)的比較 見表1。

2.2HO-1的表達(dá) 通過計數(shù)相同視野、相同部位的血紅素氧合酶陽性細(xì)胞數(shù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，誘導(dǎo)劑血晶素組血紅素氧合酶陽性細(xì)胞數(shù)較生理鹽水組及鋅原卟啉組顯著增加(P<0.01)。抑制劑鋅原卟啉組血紅素氧合酶陽性細(xì)胞數(shù)較生理鹽水組顯著減少，提示對血紅素氧合酶表達(dá)的干預(yù)比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

表1 HO-1、Bcl-2的表達(dá)和凋亡指數(shù)的比較

2.3Bcl-2的表達(dá) 通過計數(shù)相同視野、相同部位的Bcl-2陽性細(xì)胞數(shù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，誘導(dǎo)劑血晶素組Bcl-2陽性細(xì)胞數(shù)較生理鹽水組及鋅原卟啉組顯著增加(P<0.01)。抑制劑鋅原卟啉組Bcl-2陽性細(xì)胞數(shù)較生理鹽水組顯著減少，提示對血紅素氧合酶表達(dá)的干預(yù)后，Bcl-2的表達(dá)水平比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

2.4細(xì)胞凋亡的檢測結(jié)果 TUNEL染色見細(xì)胞核呈綠色熒光顆粒即凋亡細(xì)胞，傷側(cè)大腦皮質(zhì)即可見凋亡細(xì)胞，分布于損傷區(qū)及周緣。HO-1誘導(dǎo)組細(xì)胞凋亡較生理鹽水組及鋅原卟啉組顯著減少，而HO-1抑制組細(xì)胞凋亡較生理鹽水組則顯著增多，提示對血紅素氧合酶表達(dá)的干預(yù)后，神經(jīng)細(xì)胞的凋亡比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

3 討 論

腦外傷包括一系列病理生理過程，主要是機械損傷、腦水腫、腦缺血、出血等[1]，從而伴隨血紅蛋白分解和亞鐵血紅素釋放到腦組織細(xì)胞外[2]。顱腦創(chuàng)傷所致的神經(jīng)細(xì)胞損傷主要有3種形式：(1)原發(fā)性損傷(物理性的打擊)所致的神經(jīng)細(xì)胞直接死亡；(2)傷后出血、壓迫、缺血缺氧等繼發(fā)性損傷因素所引起的神經(jīng)細(xì)胞壞死；(3)炎性介質(zhì)、細(xì)胞因子、興奮性遞質(zhì)、Ca2+超載、氧自由基等因素所誘發(fā)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡。自1995年美國學(xué)者Rink首先證明顱腦創(chuàng)傷后神經(jīng)細(xì)胞存在凋亡現(xiàn)象以來，越來越多的證據(jù)表明凋亡在顱腦創(chuàng)傷所引起的神經(jīng)細(xì)胞損傷中起著重要的作用，并對其機制進(jìn)行了深入的研究。急性顱腦外傷后神經(jīng)細(xì)胞常發(fā)生遲發(fā)性損傷，主要表現(xiàn)為神經(jīng)細(xì)胞凋亡。夏磊等[3]發(fā)現(xiàn)腦外傷后1 h即可出現(xiàn)神經(jīng)細(xì)胞凋亡。細(xì)胞凋亡過程受到嚴(yán)格的基因調(diào)控。Bcl-2基因是目前公認(rèn)的內(nèi)源性抗凋亡因子[4]，它對維持顱腦損傷后神經(jīng)細(xì)胞的生存具有重要作用，并且不同的干預(yù)和刺激可上調(diào)Bcl-2 mRNA在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的表達(dá)及其蛋白合成，抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡，促進(jìn)軸突再生，從而提高神經(jīng)細(xì)胞的存活能力。其機制可能通過抑制Bax的促凋亡作用、維持細(xì)胞鈣穩(wěn)定、抑制細(xì)胞色素C進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)等，最終抑制凋亡蛋白酶(caspase)激活所介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。研究表明，Bcl-2的表達(dá)能抑制多種因素誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，抑制Bcl-2的表達(dá)具有促進(jìn)凋亡的作用[5-6]。HO-1作為亞鐵血紅素代謝的關(guān)鍵酶，HO-1在細(xì)胞抗氧化應(yīng)激損傷方面起重要調(diào)節(jié)作用[7-8]。研究表明HO-1不僅能催化血紅素生成一氧化碳、鐵、膽紅素，還具有多種生物活性：抗炎、抗氧化、抗凋亡、調(diào)節(jié)微循環(huán)的作用[9-11]。同時，HO-1的抗凋亡作用也逐漸成為研究的熱點[12-14]。Botros等[12]、Imuta等[13]研究發(fā)現(xiàn)HO-1可以降低caspase的活性、促進(jìn)Bcl-2的表達(dá)，從而抑制細(xì)胞凋亡。Parfenova等[15]研究也發(fā)現(xiàn)，HO-1與原癌基因Bcl-2 和p53家族的激活有關(guān)，這些基因的產(chǎn)物在細(xì)胞的凋亡中起重要作用。

本課題組采用通過干預(yù)HO-1的表達(dá)，檢測細(xì)胞凋亡指數(shù)和Bcl-2表達(dá)，觀察HO-1能否對抗腦外傷后神經(jīng)細(xì)胞凋亡。實驗結(jié)果提示，腦外傷后HO-1、Bcl-2表達(dá)，可以檢測大量凋亡細(xì)胞。可以發(fā)現(xiàn)不同因素的干預(yù)HO-1的表達(dá)，Bcl-2表達(dá)的表達(dá)水平隨之出現(xiàn)變化，同時改變腦組織凋亡指數(shù)，HO-1的表達(dá)越高，Bcl-2的表達(dá)也越高，大鼠的凋亡指數(shù)越低，反之亦然。由此可以推測，外傷后HO-1可能促進(jìn)Bcl-2表達(dá)，從而抑制神經(jīng)細(xì)胞的凋亡，發(fā)揮對神經(jīng)系統(tǒng)的保護(hù)作用。同時，在顱腦外傷后，它還可能通過減輕腦水腫、降低腦組織自由基的產(chǎn)生，發(fā)揮抗炎、抗氧化、抗凋亡、調(diào)節(jié)微循環(huán)的作用，從而減少神經(jīng)細(xì)胞凋亡，保護(hù)血腦屏障，改善神經(jīng)行為，最終改善腦損傷的預(yù)后。因此，在將來的顱腦外傷治療中，可以通過改變血紅素氧合酶的表達(dá)，從而改變顱腦外傷的預(yù)后，這將可能為顱腦外傷的治療提供新的思路。

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