某院肺炎克雷伯菌產質粒AmpC酶基因型及耐藥性研究

蔡 俊

(武警重慶總隊醫院檢驗科，重慶 400061)

肺炎克雷伯菌是引起臨床細菌感染最常見的革蘭陰性桿菌之一。近年來的研究顯示，該菌對頭孢曲松等第3代頭孢菌素高度耐藥，對頭霉素類及阿莫西林/克拉維酸等β內酰胺酶抑制劑復合藥的耐藥率也日益增高[1-3]，其原因可能與這些耐藥菌株不僅產生ESBLs，同時還產生對廣譜β-內酰胺類抗菌藥物具有較強滅活作用的質粒型AmpC酶有關[2-5]。及時、準確地檢測臨床產AmpC酶菌株，對于指導臨床合理應用抗菌藥物，減少耐藥菌株的產生和播散具有重要的臨床意義。現對本院臨床分離的116株肺炎克雷伯菌的耐藥性、AmpC酶表型及基因型分布情況進行檢測和分析，現將結果報道如下。

1 材料與方法

1.1菌株來源 收集2010年7月至2011年6月重慶武警總隊醫院臨床分離的無重復肺炎克雷伯菌116株，其中呼吸道標本85株,血液標本11株,中段尿10株，創面分泌物6株，其他標本來源4株。以肺炎克雷伯菌T015作為AmpC酶檢測陽性對照株，以臨床分離的對頭孢菌素全部敏感的肺炎克雷伯菌株作為AmpC酶陰性對照株，大腸埃希菌ATCC25922為藥敏質控株。

1.2病原菌的分離培養、鑒定及藥敏試驗 細菌的分離培養按照《全國臨床檢驗操作規程》(第3版)進行，采用常規生化試驗及法國生物梅里埃Vitek2-compact細菌自動鑒定儀進行細菌的鑒定。藥物敏感試驗采用Vitek2革蘭陰性桿菌藥敏卡片AST-GN13檢測，頭孢西丁、美羅培南和頭孢哌酮/舒巴坦采用紙片擴散法，根據CLSI2010、CLSI2011標準判定藥敏結果。MH培養基及藥敏紙片均為英國Oxoid公司產品。

1.3AmpC酶表型的檢測 采用頭孢西丁三維試驗法。將頭孢西丁耐藥或中介的菌株加入2 mL胰蛋白胨水中于37 ℃振蕩培養過夜，離心獲取沉淀后加入0.2 mL蒸餾水，混勻，-80 ℃及37 ℃反復凍融5次，15 000×g 4 ℃離心10 min提取上清液即為酶粗提物。試驗時將大腸桿菌ATCC25922制成0.5麥氏單位濃度，均勻涂布在M-H平板上，平板中央貼上頭孢西丁紙片，距其5 mm處用無菌刀片分4個方向挖四條放射狀溝槽，分別加入40 μL的試驗株、陽性及陰性對照株的AmpC酶粗提取物，35 ℃過夜培養后觀察結果，若狹縫與抑菌環交接處出現擴大生長區域，則測試菌株產AmpC酶陽性。

1.4AmpC基因的PCR檢測 采用質粒小量抽提試劑盒提取細菌質粒DNA，于-20 ℃保存備用。參照文獻[6]合成6對AmpC基因通用引物,多重PCR擴增產AmpC酶菌株的AmpC基因。PCR反應體系：Mg2+濃度1.5 μmol/L,dNTP 200 μmol/L,TaqE 1.5 U,0.6 μmol/L的引物MOXMF、MOXMR、CITMF、CITMR、DHAMF 和DHAMR；0.5 μmol/L的ACCMF、ACCMR、EBCMF、EBCMR；0.4 μmol/L 的FOXMF 和FOXMR，模板200 ng，10×buffer 2.5 μL，加去離子水至25 μL。反應條件：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，25個循環；然后72 ℃延伸5 min。對PCR反應出現擴增條帶的菌株，再用6對單一引物分別對該模板進行PCR反應。以肺炎克雷伯菌T015作為陽性對照株。PCR擴增產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統觀察分析結果。質粒小量抽提試劑盒、DNA Marker、TaqDNA聚合酶等PCR試劑購自上海生工生物工程有限公司。

表1 116株肺炎克雷伯菌中產酶株與非產酶株的耐藥率比較

-：表示無數據。

1.5AmpC基因基因分型 PCR產物純化和測序由上海生工生物工程有限公司進行，測序結果在GenBank上經BLAST系統與已知的AmpC基因序列進行對比,確定基因型別。

2 結 果

2.1質粒型AmpC酶檢出率 在分離到的116株肺炎克雷伯菌中，酶提取物頭孢西丁三維試驗檢測，21株AmpC酶陽性，產酶陽性率為18.1%。21株產酶菌株，其中16株分離自痰液，3株來源于尿液，創面分泌物1株，血液標本1株。

2.2質粒型AmpC基因分型 對21株產酶菌株，進行AmpC基因多重PCR擴增及DHA型單一引物PCR擴增，均擴增出一條約405 bp大小陽性條帶。電泳結果見圖1。對21株菌AmpC基因PCR擴增產物進行測序，測序結果在GenBank中經BLAST軟件分析，結果均與GenBank注冊號為HM193083.1的blaDHA-1基因序列完全相一致。

2.3肺炎克雷伯菌分離株的耐藥情況 116株肺炎克雷伯菌對抗生素的耐藥情況見表1。21株產AmpC酶肺炎克雷伯菌多重耐藥情況較嚴重，對頭孢菌素類、氨基糖甙類和喹諾酮類抗生素均高度耐藥，耐藥率在50%以上(第4代頭孢菌素頭孢吡肟除外，耐藥率為33.3%)，對加酶抑制劑復合藥氨芐西林/舒巴坦、阿莫西林/克拉維酸的耐藥率也高于85%，對頭孢哌酮/舒巴坦、哌拉西林/他唑巴坦耐藥率稍低，分別為42.9%、38.1%，但對碳青霉烯類抗生素亞安培南和美羅培南仍全部敏感。產AmpC酶肺炎克雷伯菌對氨芐西林/舒巴坦、阿莫西林/克拉維酸、頭孢替坦、頭孢西丁和頭孢他啶5種抗生素的耐藥率遠高于不產酶菌株(P<0.01)，對頭孢曲松、頭孢噻肟、頭孢唑啉和復方新諾明4種抗生素的耐藥率也高于不產酶菌株(P<0.05)，而對其余13種抗生素兩組耐藥率比較，差異無統計學意義(P>0.05)。

M:DNA Marker;1:陽性對照；2:陰性對照；3～7:臨床分離產酶株。

3 討 論

AmpC類β內酰胺酶是近年來繼ESBLs之后出現的革蘭陰性桿菌對新型β內酰胺酶類抗生素產生耐藥的另一重要機制[7]。該酶不僅能水解第1～3代頭孢菌素及頭霉素，且不被臨床上現有的β內酰胺酶抑制劑所抑制，同時，由質粒介導的AmpC酶基因能在同種或不同種屬細菌間傳播，極易造成耐藥性的播散，從而給臨床抗感染帶來了巨大的困難[8-9]。

本研究對臨床分離的116株肺炎克雷伯菌進行AmpC酶檢測，其中21株確證產AmpC酶，產酶陽性率為18.1%，與張運麗[9]和美國Rajni等[10]的報道結果相近，高于泰國Singtohin等[11]報道的0.8%、日本Yamasaki等[12]報道的0.13%以及崔雪萍等[3]2.8%的報道，但低于韓國Yoo等[13]39.3%和董方等[8]38.9%的報道。質粒介導的AmpC酶自1989年發現至今已報道有30余種基因型，且其數目還在不斷增加。不同國家、不同地區AmpC酶的流行情況及其基因型別也有所差異。目前，全球流行最多的AmpC酶基因型是CMY-2，主要分布在法國、德國、西班牙等國[14]，在美國以ACT-1基因型為主，其次為FOX-5型，法國、德國等歐洲國家以CMY-2型為主，在韓國及日本以DHA-1型為主[4，15]。在國內文獻報道肺炎克雷伯菌產AmpC酶以DHA-1基因型為主[7-8],其他基因型如CMY-2、ACT-1等亦有發現[16-17]。本研究21株產AmpC酶肺炎克雷伯菌均為DHA-1基因型，與董方等[8]、張運麗等[9]、Yoo等[13]的報道相一致。

近年來的研究報道[7-9]顯示，肺炎克雷伯菌不僅對第3代頭孢菌素高度耐藥，而且對β內酰胺酶抑制劑復合藥以及頭霉素等抗菌藥物的耐藥情況也日益嚴重，其原因可能與質粒介導的AmpC酶有關,產酶菌株對常用抗菌藥物的耐藥性通常高于非產酶菌株。本研究結果顯示，21株產AmpC酶肺炎克雷伯菌多重耐藥情況較嚴重，對第3代頭孢菌素、頭孢西丁、氨曲南以及哌拉西林的耐藥率在76%～100%，對氨基糖甙類和喹諾酮類抗菌藥物的耐藥率也在50%以上，對酶抑制劑復合藥氨芐西林/舒巴坦、阿莫西林/克拉維酸的耐藥率高于85%，但對頭孢哌酮/舒巴坦、哌拉西林/他唑巴坦以及第4代頭孢菌素頭孢吡肟的耐藥率稍低，分別為42.9%、38.1%、33.3%，對碳青霉烯類抗菌藥物亞安培南和美羅培南仍全部敏感。經統計學分析，產AmpC酶肺炎克雷伯菌對氨芐西林/舒巴坦、阿莫西林/克拉維酸、頭孢替坦、頭孢西丁和頭孢他啶的耐藥率遠高于不產AmpC酶菌株(P<0.01)，對頭孢曲松、頭孢噻肟、頭孢唑啉和復方新諾明的耐藥率也高于不產酶株(P<0.05)，而對氨基糖甙類、喹諾酮類以及碳青霉烯類等13種抗菌藥物耐藥率差異無統計學意義(P>0.05)。本研究結果表明，肺炎克雷伯菌中AmpC酶的攜帶，是導致該菌對β內酰胺酶類抗菌藥物高度耐藥的重要機制之一，對產AmpC酶肺炎克雷伯菌感染的治療，應首選碳青霉烯類抗菌藥物。

總之，本院臨床分離肺炎克雷伯菌產AmpC酶株檢出率較高，產酶菌株多重耐藥情況嚴重，臨床應根據藥敏結果合理選用抗菌藥物，以減少耐藥菌株的產生。亞安培南和美羅培南可經驗用于產AmpC酶肺炎克雷伯菌感染的治療。及時了解本地區肺炎克雷伯菌AmpC酶攜帶情況及耐藥特征，加強產酶菌株的監測，對于指導臨床合理使用抗菌藥物和有效地控制耐藥菌株的播散和流行具有十分重要的臨床意義。

[1]楊啟文,王輝,徐英春,等.中國教學醫院細菌耐藥監測研究及現狀介紹[J].中國臨床藥理學雜志,2008,24(6):570-573.

[2]周慶，呂火祥，許玲英.同產ESBLs及AmpC酶肺炎克雷伯菌的耐藥性分析[J].中華醫院感染學雜志,2011，21(1)：11-13.

[3]崔雪萍，李連青，戎建榮，等.肺炎克雷伯菌產ESBL和AmpC酶菌株基因分型[J].中華檢驗醫學雜志,2010,33(3):262-264.

[4]Yoon YK,Cheong HW,Pai H,et al.Molecular analysis of a prolonged spread of Klebsiella pneumoniae co-producing DHA-1 and SHV-12 β-lactamases[J].J Microbiol,2011,49(3):363-368.

[5]Lee CH,Su LH,Li CC,et al.Microbiologic and clinical implications of bacteremia due to extended-spectrum-beta-lactamase-producing Klebsiella pneumoniae with or without plasmid-mediated AmpC beta-lactamase DHA-1[J].Antimicrob Agents Chemother，2010,54(12):5395-5398.

[6]Perez-Perez FJ,Hanson ND.Detection of plasmid-mediated AmpC β-lactamase genes in clinical isolates by using multiplex PCR[J].J Clin Microbiol,2002,40(6):2153-2162.

[7]Jacoby GA.AmpC beta-lactamases[J].Clin Microbiol,2002，40(1):161-182.

[8]董方，徐樨巍，宋文琪.臨床分離大腸埃希菌和克雷伯菌質粒介導AmpC β內酰胺酶的研究[J].中華醫學雜志,2010,90(38):2723-2725.

[9]張運麗，陳振華,劉文恩.產質粒介導AmpC酶肺炎克雷伯菌的基因型分析與耐藥性檢測[J].中華醫院感染學雜志,2010,20(23):3641-3644.

[10]Rajni E,Rawat U,Malhotra VL,et al.Occurrence and detection of AmpC beta lactamases among clinical isolate of E.coli and K.pneumoniae causiong UTI[J].J Commun Dis，2008,40(1):21-25.

[11]Singtohin S,Chanawong A，Lulitanond A,et al.CMY-2,CMY-8b,and DHA-1 plasmid-mediated AmpC β-lactamases among clinical isolates of Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae from a university hospital,Thailand[J].Diagn Microbiol Infect Dis，2010,68(3):271-277.

[12]Yamasaki K,Komatu M,Abe N,et al.Laboratory surveillance for prospective plasmid-mediated AmpC bete-lactamases in the Kinki region of Japan[J].J Clin Microbiol,2010,48(9):3267-3273.

[13]Yoo JS,Byeon J,Yang J,et al.High prevalence of extended-spectrum-beta-lactamases and plasmid-mediated AmpC beta-lactamases in Enterobacteriaceae isolated from long-term care facilities in Korea[J].Diagn Microbiol Infect Dis，2010,67(3):261-265.

[14]Rodríguez-Ba?o J,Miró E,Villar M,et al.Colonisation and infection due to Enterobacteriaceae producing plasmid-mediated AmpC β-lactamases[J].J Infect，2012，64(2):176-183.

[15]Muratani T,Kobayashi T,Matsumoto T.Emergence and prevalence of beta-lactamase-producing Klebsiella pneumoniae resistant to cephems in Japan[J].Int J Antimicrob Agents，2006，27(6):491-499.

[16]姚麗英，李國保，李沛，等.呼吸重癥監護室產質粒介導AmpC酶和ESBLs細菌的耐藥性及基因型[J].中國感染控制雜志,2011，10(2):92-96.

[17]盧月梅,張阮章,李紅林,等.頭孢西丁耐藥肺炎克雷伯菌AmpC基因和ESBLs檢測及耐藥性分析[J].中國微生態學雜志，2010,22(7):61-63.