白介素-17對大鼠心肌梗死后心室重塑的影響

陳昭喆，宋亞輝，謝秀樂，蔡倫安，孫向東

(河南省信陽市中心醫院心內科 464000)

Th17細胞是一種新近發現的介導炎癥反應的效應CD4+輔助性T細胞亞型，白介素-17(IL-17)是其最重要和標志性的細胞因子。IL-17家族在免疫調節和炎癥反應、穩定組織器官的內環境及自身免疫性疾病的發生、發展中起關鍵的作用[1]。近來的研究表明IL-17在心肌炎等多種心血管疾病中表達增加，在心血管病慢性炎癥性過程起到了一定作用。心肌梗死(MI)后的炎癥反應是心室重塑發生的機制之一，本文旨在研究IL-17在MI大鼠心肌中的表達及其在MI后心室重塑中的作用。

1 材料與方法

1.1動物模型的分組及制備 選用體質量(200±20)g的Sprague-Dawley雄性大鼠110只(華中科技大學同濟醫學院動物實驗中心提供)，實驗動物許可證號：SCXK(鄂)2010-0009。于2010年5～12月在湖北省生物靶向治療研究重點實驗室完成，本研究遵循國家實驗動物管理條例及國家實驗動物管理實施細則。稱量大鼠體質量后用10%水合氯醛(40 mg/kg)腹腔注射麻醉。同時連接心電圖機,用肢體導聯進行心電圖監測。氣管切開后插入靜脈輸液套管針,連接奧爾科特生物公司ALC-V8型小動物呼吸機，潮氣量2～3 mL/100 g,吸呼比1∶3,呼吸頻率60 次/分鐘。經左前胸第3、4 肋間開胸,充分暴露心臟,剝除心包。用已浸入液氮內預冷5 min的銅質金屬棒(直徑5 mm，溫度：-197 ℃)充分接觸左室游離壁15 s，同一部位反復冷凍4～5次，制成MI模型。液氮冷凍范圍內的心肌明顯腫脹、變暗、室壁運動減弱，心電監護示ST段抬高至少0.5 mV，且30 min內不回落，表明MI模型制備成功，縫合胸腔。術后腹腔內注射青霉素鈉2×105U/d,連續3 d。造模成功72只，造模成功率為65.45%，將大鼠隨機分為MI對照組(C組)、小鼠同型IgG組(G組)和IL-17抗體組(A組)。每組又隨機分為2個亞組：4周組及8周組，C組至實驗終點時分別有10只、9只進入結果分析，G組至實驗終點時分別有9只、8只進入結果分析，A組至實驗終點時分別有10只、8只進入結果分析。另設假手術組8只(S組)，大鼠進行以上同樣的手術過程,但不冷凍左室游離壁心肌(實驗終點為術后第56天,至實驗終點時仍有8只進入結果分析)。全部共54只。MI大鼠各組共死亡18只，其中8只死于心力衰竭，5只死于感染，3只死于心律失常，2只死于出血，S組無脫失或死亡。手術后第1天開始，根據文獻[2]S組和C組分別腹腔注射磷酸鹽緩沖液(PBS)(0.8 mL PBS溶液，并注入0.2 mL空氣促使液體分散到腹腔內)，G組、A組分別注射小鼠同型IgG1+PBS溶液(100 μg IgG1溶于0.8 mL PBS，同樣注入0.2 mL空氣)(美國R&D公司)、小鼠抗人IL-17單克隆抗體+PBS溶液(100 μg IL-17抗體溶于0.8 mL PBS溶液，同樣注入0.2 mL空氣)(美國R&D公司)。每隔1天用藥1次，連續用藥5次。在到達各時間點后,處死各組大鼠,取出心臟標本，置于-80 ℃冰箱凍存。

1.2免疫組織化學方法測定心肌Ⅰ/Ⅲ膠原比例 石蠟切片采用鏈霉卵白素-生物素-辣根過氧化物酶復合物法(SP法)，常規脫蠟至水,3%H2O2滅活內源性過氧化物酶，微波抗原修復后,10%正常山羊血清(PBS稀釋)封閉,滴加50倍稀釋的一抗,37 ℃孵育1 h,PBS沖洗,5 min×3次。滴加生物素標記的二抗;37 ℃孵育15 min;PBS沖洗,5 min×3次，滴加辣根酶標記的鏈霉卵白素工作液;滴加DAB顯色，中性樹膠封片，以PBS代替一抗作陰性對照，測定非梗死區Ⅰ、Ⅲ型膠原染色陽性(心肌細胞間隙及血管周圍棕色條紋)區域面積,每個心臟標本隨機取8個高倍視野(×200)，膠原含量計為膠原占整個高倍視野中心肌面積的百分率，取其平均值，計算Ⅰ/Ⅲ膠原比例。

1.3Western blot檢測各組心肌組織IL-17蛋白質表達 取左心室游離壁心肌組織(50～100 mg)，勻漿后，PBS洗3次，加入適量組織蛋白裂解液，冰上裂解30 min，4 ℃ 12 000 r/min離心15 min，吸取上清液，按照BCA蛋白定量試劑盒說明進行蛋白定量測定。在電泳儀上用等量蛋白質樣品經15% SDS-PAGE分離后，轉移于硝酸纖維素膜(PVDF)膜上。1∶1 000的兔抗大鼠IL-17多克隆一抗4 ℃(美國Abcam公司，ab79056)靜置孵育過夜，PBS洗滌3次，再以1∶10 000過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG二抗(武漢飛羿公司)室溫孵育2 h，PBS充分洗滌后，在暗室用ECL試劑盒(美國 PIERCE公司)發光顯影，X光膠片壓片曝光，同時檢測GAPDH(武漢飛羿公司)的表達作為內參對照。圖片經光密度圖像掃描儀(HP)掃描,使用Qantity One程序對條帶進行灰度測定。以S組條帶灰度值為100%，其他各組條帶灰度值與S組條帶灰度值的比值，即為其相對表達量(%)。

1.4超聲心動圖相關指標 各組大鼠在手術4、8周后進行超聲心動圖檢查。大鼠麻醉后固定,應用美國GE公司Vivid7型彩色超聲診斷儀,經胸壁高頻超聲10 S探頭,頻率11.4 MHz,圖像深度2.0 cm。鼠臺向左傾斜30°，將探頭放置于胸骨左側，選取標準左室乳頭肌短軸切面和長軸切面在二維影像指導下采用M型超聲測量以下指標：左室舒張期內徑(left ventricular end-diastolic dimension，LVEDD)、左室收縮內徑(left ventricular end-systole dimension，LVESD)、左室短軸縮短率(left ventricular fractional shorting，LVFS)、左室射血分數(left ventricular ejection fraction，LVEF)、舒張末期容積(end-diastolic volume，EDV)、收縮末期容積(end-systole volume，ESV)。每一測定值均取3個連續完整心動周期測量的平均值。

2 結 果

2.1免疫組化檢測Ⅰ/Ⅲ膠原比例 與S組相比，MI各組大鼠心肌組織在4、8周時的Ⅰ/Ⅲ膠原比例均明顯高于S組(P<0.05)；與C組和G組相比，A組在4、8周的Ⅰ/Ⅲ膠原比例明顯改善(P<0.05)；而G組與C組相比無明顯變化(P>0.05)，見表1。

表1 各組Ⅰ/Ⅲ膠原比例

2.2Western blot檢測各組大鼠心肌IL-17的表達 與S組相比，MI各組大鼠心肌組織在4、8周時的IL-17表達水平均明顯高于S組；與C組和G組相比，A組在4、8周的IL-17表達水平明顯低于兩組(P<0.05)；而G組與C組相比無明顯變化(P>0.05)。見圖1。

★：P<0.05，與S組比較；※：P<0.05，A組與C組比較。

2.3超聲心動圖結果 超聲心動圖結果顯示大鼠左心室結構和功能呈現動態變化，C組、G組、A組大鼠LVEDD、LVESD、EDV、ESV較S組均逐漸升高；LVEF、LVFS較S組均有所降低(P<0.05)，以8周最明顯，提示8周后構建大鼠MI模型成功，而S組各項指標無明顯變化。與C組相比，A組大鼠LVEDD、LVESD、LVEDV、LVESV降低，而LVEF、LVFS升高，心功能各項指標均有改善(P<0.05)，而G組與C組相比則未見明顯改善(P>0.05)。8周的變化趨勢較4周更顯著。見圖2、表1。

表2 各組大鼠超聲心動圖檢查結果比較±s)

A：S組；B：C組；C：G組；D：A組。

3 討 論

IL-17是Th17細胞來源的強力炎癥前細胞因子，可調節前炎性因子、趨化因子等的產生及分泌，在多種自身免疫介導的組織損傷及炎癥過程中十分關鍵。IL-17主要是通過誘導細胞釋放前炎癥因子及動員中性粒細胞的細胞因子而發揮作用，而近來的一些研究證明,IL-17在多種心血管疾病中如：自身免疫性心肌炎、病毒性心肌炎、擴張型心肌病、不穩定的冠心病等表達增加,可能在心血管病慢性炎癥性過程起到了一定作用。

本研究發現，與S組相比，C組、G組和IL-17抗體組4周、8周組大鼠心肌組織中IL-17的表達均明顯升高(P<0.05)，同時超聲心動圖相關參數明顯惡化(P<0.05)；Ⅰ/Ⅲ膠原比例均明顯高于S組(P<0.05)；而MI大鼠經抗體干預處理后,心肌組織IL-17表達顯著減少(P<0.05),A組在4周、8周的Ⅰ/Ⅲ膠原比例及超聲心動圖相關參數明顯改善(P<0.05)，以上結果提示在MI發生、發展中，心室重塑的發生可能與心肌組織IL-17表達有關。MI的過程是炎癥反應的過程，免疫介導的炎癥反應則起到加重心肌損傷和擴大MI范圍的作用。壞死的心肌組織引起補體的激活、細胞因子的釋放、炎癥和免疫細胞的趨化和浸潤，同時也通過病理性自身免疫應答參與了心肌損傷。研究[3-4]發現，炎癥性細胞因子，如腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素-1(IL-1)、白介素-6(IL-6)、IL-17等，在不同大鼠動物模型的血清或組織中水平較正常健康狀態都有所升高。MI后會伴隨有一系列細胞因子和黏附分子的表達，TNF-α、IL-1、lL-6和趨化性細胞因子是啟動炎癥反應的關鍵細胞因子，又被稱為前炎癥細胞因子，前炎癥細胞因子與MI后心室重塑的發展有密切關系。在MI后梗死區和非梗死區都有炎性細胞浸潤，細胞因子參與的炎癥反應被認為是心室重塑形成的必備條件，心室重塑過程伴有神經-體液和炎癥性細胞因子的激活，同時這些因素的激活又促進心室重塑的發展。

Dolores等[5]認為,IL-17可能通過自分泌和旁分泌機制影響成纖維細胞的生物學活性,非免疫性細胞如小鼠心肌成纖維細胞存在低水平的IL-17基礎分泌,IL-17通過IL-17 RA和IL-17 RC依賴方式刺激成纖維細胞的膠原的產生，心臟成纖維細胞通過刺激產生膠原和其他細胞外基質在心室重塑和纖維化中起一定作用。Feng等[2]研究發現IL-17通過OPG/RANK/RANKL和MMP/TIMP系統參與自身免疫性心臟疾病和非自身免疫性心臟疾病引起的心力衰竭心臟重塑的病理過程，可能是各種心力衰竭心臟重塑的共同致病因子。Liu等[6]研究發現,IL-17能顯著增加心肌成纖維細胞MMP-2和MMP-9的表達和中等程度降低TIMP-1、TIMP-2的表達,給予抗IL-17抗體后,心肌成纖維細胞MMP-2和MMP-9的表達顯著減少,而TIMP-1和TIMP-2的表達則升高。Kaliyamurthi等[7]研究發現人心肌成纖維細胞表達低水平的MMP-1 mRNA、IL-17呈時間、劑量依賴性誘導的表達,由IL-17誘導的MMP-1 mRNA表達的作用能被IL-17或IL-17R中和抗體所阻滯。而且除MMP-1外,IL-17尚可誘導MMP-2、3、9和13的表達,后者在心肌重塑中起重要作用。因此，IL-17有可能是通過增加各種MMPs包括MMP-1的表達在DCM中起一定作用，抑制IL-17的表達可能會降低心肌炎癥和損傷后的纖維化和重塑。近來的研究發現,IL-17同IL-1、TNF-α有協同作用[8]，可以放大加強其致炎效應[9-10]，這可能是IL-17導致MI后心室重塑的另一機制。聯合運用IL-17和TNF-α抑制劑能夠更好地控制炎癥及增強調節性T細胞的功能。本實驗研究也發現IL-17在8周和4周的變化趨勢與超聲心動圖相關參數的變化趨勢不盡相符，說明心室重塑除了IL-17自身作用外尚有其他的機制比如TNF-α等其它細胞因子的作用因素。

綜上所述，MI后心肌組織大量表達IL-17可能與MI后心室重塑的發生有關，抗IL-17治療可能成為心臟重塑治療的潛在策略和新的靶點，進一步研究IL-17的作用可能會發現心室重塑新的發生機制，從而為MI后心室重塑的預防和治療帶來新的視角和方法。

[1]Langrish CL,Chen Y,Blumenschein WM,et al.IL-23 drives apathogenic T cell population that induces autoimmune inflammation[J].J Exp Med,2005,201(10):233-240.

[2]Feng WW,Li WM,Liu W,et al.IL-17 induces myocardial fibrosis and enhances RANKL/OPG and MMP/TIMP signaling in isoproterenol-induced heart failure[J].Exp Mol Pathol，2009，87(3):212-218.

[3]Zaba LC，Cardinale I，Gilleaudeau P，et al.Amelioration of epidermal hyperplasia by TNF inhibition is associated with reduced Th17 responses[J].J Exp Med，2007，204(13):3183-3194.

[4]Hyung WL，Lee J，Peter H，et al.Human Th17 cells share major trafficking receptors with both polarized effector T cells and FOXP3+regulatory T cells[J].Immunol,2008,180:122-129.

[5]Dolores MC,Feldman MD,Srinivas M,et al.IL-17 stimulates MMP-1 expression in primary human cardiac fibroblasts via p38 MAPK- and ERK1/2-dependent C/EBP-β,NF-KB,and AP-1 activation[J].Am J Physiol Heart Circ Physiol,2007,293(6):H3356-H3365.

[6]Liu W,Feng W,Wang F.Osteoprotegerin/RANK/RANKL axis in cardiac remodeling due to immuno-inflammatory myocardial disease[J].Exp Mol Pathol,2008,84(3):213-217.

[7]Kaliyamurthi V,Srinivas M,Dolores M.Resveratrol inhibits high glucose-induced PI3K/Akt/ERK-dependent interleukin-17 expression in primary mouse cardiac fibroblasts[J].Am J Physiol Heart Circ Physiol,2008,294(5):H2078-H2087.

[8]Mangan PR,Harrington LE,O′Quinn DB,et al.Transforming growth factor beta induces development of the T(H) 17 lineage[J].Nature,2007,441(4):231-234.

[9]McAllister FA,Henry JL,Kreindler PJ,et al.Role of IL-17A,IL-17F,and the IL-17 receptor in regulating growth-related oncogene-alpha and granulocyte colony-stimulating factor in bronchial epithelium:implications for airway inflammation in cysticfibrosis[J].Immunol,2005,175(1):404-412.

[10]Komiyama YS,Nakae T,Matsuki A,et al.IL-17 plays an important role in the development of experimental autoimmunity encephalomyelitis[J].Immunol,2006,177(1):566-573.