SOX7對胃癌MKN45細胞株體外遷移侵襲的影響

宋隆明

(重慶市合川區中西醫結合醫院外科 401520)

胃癌是常見的消化道惡性腫瘤，在世界范圍內其發病率和致死率均排在所有惡性腫瘤的第4位[1]。在中國，其發病率和死亡率高居所有惡性腫瘤的首位。目前，胃癌發生、發展的機制尚不清楚，其診斷和治療仍是醫學界懸而未決的難題。從分子生物學的角度來探討這些問題將是未來解決胃癌治療難題的重要手段。SOX7是近期發現的Wnt/β-catenin信號通路的關鍵的負性調控因子，SOX基因根據HMG盒基因序列的同源性分為10個亞組,SOX7是SOX家族F亞組的成員之一，它可以和β-catenin競爭TCF/LEF(T cell factor/lymphoid enhancer factor)上的結合位點，從而抑制Wnt/β-catenin信號通路的激活[2]。已有報道，SOX7在一些惡性腫瘤中低表達，如乳腺癌、肝癌、前列腺癌和結腸癌，且和這些腫瘤的進展有明顯的相關性[3-4]；作者在前期的研究中已經發現SOX7在胃癌組織中低表達，且其表達水平與胃癌病灶的大小、淋巴結轉移和臨床分期有關。為了進一步驗證SOX7抑制胃癌進展的作用，作者通過在MKN45胃癌細胞中外源性的過表達SOX7，觀察細胞增殖和侵襲能力的改變，并檢測與腫瘤轉移相關的Wnt/β-catenin信號通路下游靶蛋白MMP-9的表達情況，初步探討其分子機制。

1 材料與方法

1.1細胞培養 人類低分化胃癌細胞株MKN45購于中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫，在含10%胎牛血清(四季青生物工程有限公司)的RPMI-1640培養基(Hyclone公司)中，37 ℃、5% CO2條件下培養。倒置相差顯微鏡下觀察細胞生長情況，1～2 d換液，生長至80%覆蓋率時用胰酶消化傳代。

1.2質粒轉染及穩定表達SOX7細胞株建立 從GeneBank中調取SOX7的CDS區堿基序列(NM_031439)，委托北京基諾生物有限公司合成pIRES2-EGFP-SOX7重組質粒和pIRES2-EGFP質粒。將對數期生長的MKN45細胞接種至6孔板中，待細胞長至50%融合時，每孔按質粒和脂質體體積比1∶2.5加1 mL無血清培養基進行轉染，培養8 h后，更換為普通培養基。24 h后熒光顯微鏡觀察轉染效率，并加入終濃度400 μg/mL的G418(Sigma公司)進行篩選，2周后挑選發綠色熒光的單克隆進行擴大培養，培養基中加入200 μg/mL的G418維持。相同的方法用pIRES2-EGFP質粒轉染細胞作為對照組。

1.3Real-time PCR檢測 取對數生長期的細胞，待其生長至80%融合后，用Trizol法提取總RNA，用紫外分光光度計在260、280 nm處測吸光度值，計算RNA含量和純度。按cDNA反轉錄酶試劑盒(TaKaRa公司)說明書進行操作，取2 μg RNA反轉錄為cDNA，以cDNA為模板進行PCR擴增，PCR引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。SOX7上游引物序列為5′-CAA GAT GCT GGG AAA GTC GT-3′，下游引物序列為5′-CCG GTA CTT GTA GTT GGG GTA GT-3′，產物長度118 bp；內參GAPDH上游引物序列為5′-AGC CTC AAG ATC ATC AGC AAT G-3′，內參GAPDH下游引物5′-TGT GGT CAT GAG TCC TTC CAC G-3′。反應體系：總體積20 μL，其中cDNA 1.5μL，上、下游分別1 μL，SYBR mix 10 μL(TaKaRa公司)，滅酶水6.5 μL。擴增條件：95 ℃預變性3 min，95 ℃變性10 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，采集熒光，獲取熔解曲線。以GAPDH為內參，使用2-ΔΔCt方法進行分析。

1.4Western blot檢測 取對數生長期的細胞，待其生長至80%融合后,使用RIPA強效裂解液(碧云天公司)提取總蛋白，用BCA蛋白定量試劑盒(碧云天公司)進行定量，根據分子量配置10% SDS-PAGE膠，上樣量100 μg，40 V恒壓電泳，待溴酚藍離開濃縮膠后，恒壓80 V電泳至溴酚藍到玻板底部終止，恒流250 mA將蛋白轉印至PVDF膜上，脫脂奶粉封閉1 h，SOX7一抗1∶100(Santa Cruz公司)，MMP-9一抗1∶100(博奧森公司)或GAPDH一抗1∶1 000(碧云天公司)4 ℃孵育過夜。TBST洗膜3次，每次10 min；加二抗37 ℃孵育90 min，洗膜3次，每次10 min；ECL化學發光試劑盒顯影(碧云天公司)。用Quantity One 4.6.2軟件對條帶灰度值進行分析。

1.5細胞增殖率檢測 用MTT細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒(碧云天公司)檢測各組細胞的增殖率，操作按照試劑盒說明進行。

1.6細胞侵襲檢測 將各組細胞按1×105種于底部鋪有Matrigel膠(BD公司)的Millicell小室中(Millipore公司)，小室內加入含1%胎牛血清的培養基并將之放于24孔板上，24孔板內加入含10%胎牛血清的培養基作為誘導，培養24 h后用棉簽去除小室底部的膠和未穿透的細胞，用4%的多聚甲醛固定小室外穿透的細胞，吉姆薩進行染色，取隨機5個100倍視野計數穿透細胞進行分析。

2 結 果

2.1SOX7過表達的MKN45細胞穩定株建立 pIRES2-EGFP-SOX7和pIRES2-EGFP轉染細胞后，經G418篩選后的穩定株均顯現綠色熒光(圖1A)。轉染SOX7質粒組的SOX7 mRNA和蛋白水平明顯高于轉染空白質粒組和親代MKN45細胞組(圖1B)。

A1：篩選穩定過表達的SOX7單克隆；A2：轉染空白載體的MKN45細胞；A3： SOX7轉染組。B1：篩選穩定過表達的SOX7單克隆；B2：轉染空白載體的MKN45細胞；B3： SOX7轉染組；轉染SOX7質粒組的mRNA和蛋白水平明顯高于轉染空白質粒組和親代MKN45細胞組；轉染SOX7質粒組的MMP9蛋白表達明顯低于轉染空白質粒組和親代MKN45細胞組。C1：篩選穩定過表達的SOX7單克隆；C2：轉染空白載體的MKN45細胞；C3： SOX7轉染組；轉染SOX7質粒組的侵襲能力明顯低于轉染空白質粒組和親代MKN45細胞組。D1：篩選穩定過表達的SOX7單克隆；D2：轉染空白載體的MKN45細胞；D3： SOX7轉染組；轉染SOX7質粒組的增殖能力明顯低于轉染空白質粒組和親代MKN45細胞組。

2.2SOX7過表達抑制MKN45細胞增殖和侵襲能力 轉染SOX7質粒組的侵襲能力明顯低于轉染空白質粒組和親代MKN45細胞組(P<0.05)，見圖1C。轉染SOX7質粒組(60±9)的增殖能力明顯低于轉染空白質粒組(122±17)和親代MKN45細胞組(137±24)，P<0.05，見圖1D。

2.3SOX7過表達下調MMP-9表達 轉染SOX7質粒組的MMP-9蛋白表達明顯低于轉染空白質粒組和親代MKN45細胞組(P<0.05)，見圖1B。

3 討 論

Wnt/β-catenin信號通路是一種對細胞增殖和分化具有重要調節作用的信號傳導系統。越來越多的研究證明Wnt/β-catenin信號通路在腫瘤發生、發展中也同樣發揮了重要作用[5]。β-catenin是Wnt/β-catenin信號通路中關鍵性因子，它進入細胞核后，能與TCF/LEF結合，激活其下游的與腫瘤轉移和發生有關的靶基因，如CD44[6]、MMP-9[7]及C-MYC[8]等，從而促進腫瘤的進展。SOX7是近期發現的Wnt/β-catenin信號通路的關鍵負性調控因子，它可以和β-catenin競爭TCF上的結合位點，從而抑制Wnt/β-catenin信號通路的激活。而且，SOX7在胞漿中還可以通過促進β-catenin-AXIN1-GSK3β-APC復合體的形成，促進β-catenin的磷酸化降解，阻止β-catenin進入胞核發揮作用[9]。

在前期的研究中，作者已經發現SOX7在胃癌組織中低表達，且其表達水平與胃癌的大小，淋巴結轉移和臨床分期有關。為了進一步驗證SOX7抑制胃癌進展的作用，作者通過在MKN45胃癌細胞中外源性的過表達SOX7，觀察細胞增殖和侵襲能力的改變，結果發現SOX7過表達可以降低MKN45細胞的增殖和侵襲能力，這與之前在結腸癌中的研究結果類似[10]，作者推測其可能的機制與SOX7負性調控Wnt/β-catenin信號通路有關。為了驗證這一假設，作者檢測了過表達SOX7前后MKN45中與腫瘤轉移相關的Wnt/β-catenin信號通路下游靶蛋白MMP-9的表達情況，MMP-9是腫瘤轉移過程中的一個重要蛋白，它可以降解細胞外基質，為癌細胞的游走轉移提供必要的通道[11]。實驗結果提示過表達SOX7后MMP-9的表達是明顯下調的，因此，作者認為在胃癌MKN45細胞中，過表達SOX7可以通過和β-catenin競爭TCF/LEF結合位點，阻止β-catenin-TCF/LEF復合體的形成，繼而抑制下游靶蛋白而發揮作用。此外，過表達SOX7可以增加胞漿中游離SOX7蛋白的水平，SOX7在胞漿中可以促進β-catenin-AXIN1-GSK3β-APC復合體的形成，增加β-catenin的磷酸化降解。Wnt/β-catenin信號通路下游還有許多與上皮細胞間質轉化及腫瘤干細胞相關的因子[12]，如重要的間質標志物VIMENTIN[13]，它已經被證明是Wnt/β-catenin信號通路下游的靶點，因此，SOX7對于抑制EMT可能也有重要的作用，也可能是SOX7發揮抑癌作用的潛在機制。此外，有研究發現，SOX7和SOX18在斑馬魚發育過程中調節其血管生成[14]，但是目前尚無SOX7對于腫瘤血管生成調控的研究，腫瘤血管生成是腫瘤進展的必要條件，探討SOX7對于腫瘤血管生成的作用對于腫瘤發生、發展的研究可能有潛在的意義。

綜上所述，作者在胃癌組織中發現SOX7可能是胃癌進展的一個重要抑制因子，隨后在體外研究中進一步證實了這一現象，并初步探討了可能的機制。研究發現，SOX7不僅可以抑制胃癌細胞的增殖，促進胃癌細胞的轉移，并且可能對于胃癌細胞的凋亡、耐藥和血管生成有一定的調控作用。在下一步的研究中作者將在檢測更多的Wnt/β-catenin

信號通路下游靶蛋白(如CD44、C-MYC、VIMENTIN)的同時，橫向的探討SOX7對胃癌細胞凋亡、耐藥性和血管生成的作用，并且縱向的對SOX7和TCF/LEF的關系進行深入探討，本研究可能為胃癌的診斷和治療提供一個新的靶點。

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