塞來昔布對急性白血病原代細胞增殖及血管新生的影響*

葛曉華，趙小強，阮林海

(河南科技大學第一附屬醫院血液科，河南洛陽 471003)

越來越多的證據表明，環氧化酶-2(COX-2)的表達不僅與炎癥有關，且與多種惡性腫瘤有關。COX-2抑制劑可以抑制腫瘤細胞增殖，誘導細胞凋亡，抑制腫瘤細胞的侵襲和轉移[1]。目前，特異性COX-2抑制劑塞來昔布用于白血病治療的研究較少，且僅限于細胞株。因此，本研究以塞來昔布作用于急性白血病原代細胞，觀察其對白血病細胞增殖的影響，并探討其作用機制，為其臨床應用提供理論依據。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2010年2月至2011年7月本院血液科初診未治的急性白血病患者16例，其中，急性髓系白血病患者12例(M26例，M33例，M53例)，急性淋巴細胞白血病患者4例(L12例，L22例)，所有患者均符合國內診斷及療效標準[2]，排除合并心、肝、腎功能異常，感染，合并其他惡性腫瘤及自身免疫性疾病者。其中，男10例，女6例；年齡5～68歲，中位36歲。

1.2方法

1.2.1主要儀器與試劑 CO2細胞培養箱、普通及倒置顯微鏡、COX-2抑制劑塞來昔布膠囊購自輝瑞公司；RPMI1640培養基、胎牛血清、MTT、通用型SP-9000試劑盒、鼠抗人血管內皮生長因子(VEGF)單克隆抗體、兔抗人堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)單克隆抗體均購自北京中杉金橋生物技術有限公司；兔抗人多克隆轉化生長因子-β(TGF-β)抗體(1∶60)購自武漢博士德生物技術公司。

1.2.2MTT法測定塞來昔布對急性白血病原代細胞增殖的抑制作用 Ficoll密度梯度離心法取患者骨髓單個核細胞分離，接種于含體積分數為10%滅活胎牛血清的RPMI1640培養基中常規培養。取指數生長期的細胞，調整細胞密度為1×105個/mL，接種于3個96孔板中，每孔細胞懸液100 mL，加入用RPMI1640培養液稀釋的塞來昔布，使其終濃度分別為20、40、60、80、100 mmoL/L，并各設5個復孔，同時設對照組(不加塞來昔布)，每組細胞培養不同時間(24、48、72 h)，實驗結束前4 h，每孔加入MTT 10 mL(5 mg/mL)，再繼續培養4 h后從培養箱中取出，每孔各加入100 mL 10%十二烷基磺酸鈉(SDS)終止反應,37 ℃存放過夜，用酶標儀于570 nm波長處檢測吸光度A值。根據如下公式計算細胞抑制率：細胞生長抑制率=[對照組A值-實驗組A值]/對照組A值×100%。

1.2.3免疫組化法檢測VEGF、bFGF、TGF-β的表達 收集經80 mmoL/L塞來昔布處理培養48 h的單個核細胞和未經處理的單個核細胞，制備細胞滴片，晾干后置于4 ℃丙酮固定液中固定10 min，PBS液洗滌5 min×3次，自然晾干。細胞滴片置于即用型過氧化物酶阻斷劑中，室溫孵育15 min，PBS洗滌4 min×3次。滴加5%正常山羊血清，室溫孵育20 min，實驗組滴加一抗工作液50 mL，對照組用PBS代替一抗，置于底部有體積分數20%甘油保濕盒中，4 ℃過夜。PBS洗滌5 min×3次，滴加生物素標記的二抗50 mL，室溫下孵育30 min，PBS洗滌5 min×3次。DAB顯色，蘇木素復染，中性樹膠封片。

表1 VEGF、bFGF、TGF-β在急性白血病原代細胞培養48 h后的表達

1.2.4結果判定 細胞核或細胞質染色為棕黃色或深棕黃色者為陽性細胞，根據陽性細胞所占比例及顯色程度，參照1997年全國免疫組化技術診斷標準化專題研討會意見，對陽性細胞進行積分:陽性顆粒所占細胞面積比例小于 50%,見淺黃色顆粒,明顯高于背景底色，記1分；陽性顆粒所占細胞面積比例為50%～70%,見較深黃色顆粒，記2分；陽性顆粒所占細胞面積比例大于70% ，見大量深黃色顆粒，記3分；每片計數并計算200個細胞中陽性細胞率及陽性積分。

2 結 果

2.1塞來昔布對急性白血病原代細胞生長抑制率的測定 塞來昔布對急性白血病原代細胞的生長增殖有較強抑制作用，且隨著藥物濃度的增大、作用時間的延長，抑制作用越明顯，細胞生長的抑制率逐漸升高，塞來昔布終濃度在0～100 μmol/L能顯著抑制急性白血病原代細胞的生長和增殖，抑制率從3.48%增加到70.24%，且呈時間和劑量依賴性，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖1。

2.2VEGF、bFGF、TGF-β在急性白血病原代細胞培養48 h后的表達 見表1。

圖1 塞來昔布對急性白血病原代細胞的抑制率

2.3急性白血病初發未治患者(對照組)單個核細胞VEGF與bFGF、TGF-β水平的相關性 采用直線相關分析顯示，VEGF表達與bFGF、TGF-β表達均呈正相關(r分別為0.534、0.408，P<0.01)。

3 討 論

塞來昔布是一種選擇性COX-2的抑制劑，是目前惟一被美國食品藥物管理局(FDA)批準治療家族性腺瘤性息肉患者的輔助治療的非甾體抗炎藥。但塞來昔布的抗癌效果及分子機制尚不完全清楚。研究表明COX-2參與實體瘤中多種血管生長因子調控的血管生成包括VEGF、白細胞介素-6(IL-6)、bFGF等，影響腫瘤細胞與基質黏附，促進腫瘤細胞生存和耐藥，阻斷上述通路可抑制腫瘤細胞增殖、促進凋亡[3]。Lang等[4]用大鼠角膜模型觀察到塞來昔布能抑制血管形成，并認為塞來昔布強有力的抗血管形成活性可能是其抑制腫瘤生長和轉移的主要機制。國外有學者研究塞來昔布對人類慢性粒系白血病細胞株的影響，其結果表明塞來昔布在體外能誘導人慢性粒性白血病細胞系K562細胞凋亡[5]。這些結果表明，塞來昔布在治療慢性粒細胞白血病方面有廣泛的前景。但塞來昔布對急性白血病原代細胞的影響在國內外少見報道。

本實驗將COX-2抑制劑塞來昔布作用于原代培養的急性白血病細胞，觀察其對促血管新生因子的作用。實驗結果發現塞來昔布終濃度在0～100 μmol/L能顯著抑制急性白血病原代細胞的生長和增殖，抑制率從3.48%增加到70.24%，且呈時間和劑量依賴性，差異有統計學意義(P<0.05)。免疫組化結果顯示實驗組VEGF 、bFGF的陽性率均明顯高于對照組(P<0.01)，但TGF-β陽性率與對照組比較，差異無統計學意義(P>0.05)。這表明COX-2抑制劑塞來昔布在體外能顯著下調白血病細胞VEGF bFGF表達，但對TGF-β表達基本無改變，這充分說明了血管新生是一個復雜的過程，它受眾多正性與負性調節因子的控制，兩者的平衡才使血管增生維持在生理范圍內。急性白血病的發病過程中涉及多種細胞因子共同作用的調控，其中，血管新生因子如COX-2、VEGF、bFGF、白細胞介素-8(IL-8)在血管新生過程中的作用最為重要，而TGF-β是最主要的負調控因子之一，TGF-β/Smads作為一種腫瘤抑制信號，在乳腺癌[6]、胃癌[7]等實體瘤中有信號降低或異常的表達，同時它能下調造血刺激因子及腫瘤蛋白的表達。相反，另有學者Jung等[8]發現 TGF-β在白血病及淋巴瘤細胞中可通過阻斷瘤細胞Fas途徑抑制腫瘤細胞的凋亡，同時還可通過上調腫瘤細胞中白介素-1β轉換酶抑制蛋白(c-FLIPL)的表達使腫瘤細胞重新獲得抗凋亡能力，這些因素導致了腫瘤細胞的生長及遷移。而本實驗結果表明TGF-β在對照組和實驗組的陽性率差異無統計學意義(P>0.05)，這可能與TGF-β在白血病發展中的負調控因子的作用減弱有關，同時進一步表明了在白血病細胞生長的過程中促血管生長因子起重要的作用，因此，通過抑制白血病血管的新生可以達到抑制白血病細胞生長的目的。而本實驗的結果也證實了這一點，其機制可能與塞來昔布減弱了刺激血管新生反應調控的信號有關，進而通過抑制血管新生而發揮抗白血病的效應。這說明塞來昔布可能是治療急性白血病的潛在藥物，同時認為VEGF、bFGF、TGF-β等血管新生因子是血液腫瘤治療的靶點。

有研究表明COX-2能促進VEGF、bFGF及血小板趨化因子(PDGF)等的表達，使腫瘤組織內新生血管形成[9]。VEGF 是一種作用最強和特異性最高的血管內皮細胞有絲分裂素,它通過與其受體特異性的結合,具有促進內皮細胞的增殖和遷移、促進血管再生、增加血管的通透性以及維持血管的功能,與腫瘤血管新生密切相關。bFGF是成纖維細胞生長因子(FGF)超家族成員之一，它主要通過刺激內皮細胞的增生和遷移來促進腫瘤血管的生成。Uefuji等[10]發現在腫瘤患者中，COX-2表達高的患者微血管密度(MVD)比COX-2表達低者增加明顯，這說明COX-2與骨髓的微血管密度有關，同時它能夠誘導VEGF和bFGF等多種促血管生成因子的表達，進而促進腫瘤的生成?？梢奀OX-2與VEGF、bFGF在腫瘤的發生、發展過程中存在一定的相關性。同時有研究表明，COX-2還可提高VEGF、bFGF、TGF-β以及PDGF的表達，促進腫瘤血管的生成[11]。Ishjko等[12]在對宮頸腺樣囊性癌(ACCs)的研究中，發現COX-2與VEGF的表達水平明顯高于宮頸原位癌，且發現在ACCs中有明顯的血管新生現象，這提示COX-2的高表達很可能會引起VEGF的過度合成，最終促使腫瘤新生血管的生成。Dias等[13]證實白血病細胞分泌的 bFGF 可引起內皮細胞釋放VEGF，這說明VEGF 與 bFGF 有協同作用，這與本實驗的結果一致，即VEGF與bFGF的表達在對照組呈正相關(r=0.534，P<0.01)。本實驗還發現VEGF與TGF-β的表達在對照組也呈正相關(r=0.408，P<0.01)，這充分說明了VEGF、bFGF、TGF-β共同參與了白血病血管新生的過程。而另外在一些藥物實驗中發現,COX-2 選擇性抑制劑NS398、吲哚美辛等可通過抑制 VEGF、bFGF、 PDGF 等抑制白血病細胞的生長，同時在體外實驗中也發現COX-2特異性抑制劑NS2398可通過增加自身的凋亡速度而明顯降低白血病細胞的生存期，這與大量資料證明的結果一致[14-15]，即COX-2抑制劑有極為廣泛的抗白血病作用，能直接抑制白血病細胞的生長，其機制比較復雜，除了與抑制白血病血管新生有關外，還通過調控癌基因和抑癌基因，下調凋亡拮抗基因的表達，抑制COX-2的活性，影響表皮生長因子受體(EGFR)，蛋白激酶C(PKC)信號轉導通路，誘導細胞周期停滯和細胞凋亡，抑制血管生成，抑制尿激酶的活性和基質金屬蛋白酶-2/9(MMP2/9)的分泌，誘導特異的細胞周期蛋白表達，以及通過線粒體途徑等誘導白血病細胞凋亡。可見，白血病血管新生調控網絡系統極其復雜，其調節機制有待進一步研究。

[1]Chen Q,Shinohara N,Abe T,et al.Significance of COX-2 expression in human renal cell carcinoma cell lines[J].Int J Cancer,2004,108,(6):825-832.

[2]張之南,沈悌.血液病診斷及療效標準[M].3版.北京:北京科學出版社，2007:131-134.

[3]Giles FJ,Kantarjian HM,Bekele BN,et al.Bone marrow cyclooxygenase-2 levels are elevated in,chronic-phase chronic myeloid leukemia and are associated with reduced survival[J].Br J Haematol,2002,119(1):38-45.

[4]Lang S,Lauffer L,Clausen C,et al.Impaired monocyte function in cancer patients restoration with a cyclooxygenase-2 inhibitor[J].FASEB J,2003,17(2):286-288.

[5]Subhashini J,Mahipal SV,Reddanna P.Anti-proliferative and apoptotic effects of celecoxib on human chronic myeloid leukemia in vitro[J].Cancer Lett,2005,224(1):31-43.

[6]Sterling JA,Wu L,Banerji SS.PARP regulates TGF-beta receptor type II expression in estrogen receptor-positive breast cancer cell lines[J].Anticancer Res,2006,26(3A):1893-1901.

[7]Kim SS,Shetty K,Katuri V,et al.TGF-beta signaling pathway inactivation and cell cycle deregulation in the development of gastric cancer:role of the beta spectrin,ELF[J].Biochem Biophys Res Commun,2006,344(4):1216-1223.

[8]Jung YJ,Kim JY,Park JH.TGF-beta1 inhibits Fas-mediated apoptosis by regulating surface Fas and cFLIPL expression in human leuaemai/lymphoma cell[J].Int J Mol Med,2004(13):99-104.

[9]Turini ME,Dubois RN.Cyclooxygenase-2:A therapeutic target[J].Annu Rev Med,2002(53):35-57.

[10]Uefuji K，Iehikura T，Moehizuki H.Cyclooxygenase-2 expression is related to prostaglandin biosynthesis and angiogenesis in human gastric cancer[J].Clin Cancer Res,2000,6(1):135-138.

[11]Cianchi F，Cortesini C，Bech P．Up-regulation of cyclooxygenase-2 gene expression correlates with tumor angiogenesis in human colorectal cancer[J]．Gastroenterology，2001，121(6)：1339-1347．

[12]Ishjko O，Sumi T，Yoshdal H.Cyclooxygenase-2 expressjon in an adenoid cystic carcinoma of the uterinc cervix[J]．Oncol Rep，2001,8(5)：1023-1025.

[13]Dias S,Choy M,Alitalo K,et al.Vascular endothelial growth factor(VEGF)-C signaling through FLT-4(VEGFR-3)mediates leukemic cell proliferation,survival,and resistance to chemotherapy[J].Blood,2002,99(6):2179-2184.

[14]Mustafa C,Suleyman B,Muzaffer D,et al.Overexpression of cyclooxygenase-2 in multiple myeloma:aassociation with reduced survival[J].Am J of Hematology,2005,80(3):169-173.

[15]Cui W,Yu CH,Hu KQ.In vitro and in vivo effects and mechanisms of celecoxib-induced growth inhibition of human hepatocellular carcinoma cells[J].Clin Cancer Res,2005,11(22):8213-8221.