高效液相色譜法檢測糖化血紅蛋白的方法學(xué)評價

張文華，侯晗宇，張建榮，王菊英，周立榮（寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院醫(yī)學(xué)實驗中心，銀川 750004）

糖化血紅蛋白（HbA1c）作為糖尿病篩選、診斷、血糖控制、療效評價的有效指標，在臨床上已廣泛使用，是監(jiān)測糖尿病的金標準［1］，高效液相色譜法（HPLC）則被列為檢測 HbA1c參考方法。本中心引進一臺日本TOSOH公司HLC－723 G8全自動糖化血紅蛋白分析儀，除用于測定HbA1c外，還可獲得Hb A1、血紅蛋白F（HbF）的值，現(xiàn)對其檢測HbA1c性能進行評價。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣本來源 乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝全血樣本，來自本院門診及住院患者。

1.1.2 儀器 日本TOSOH公司HLC－723 G8全自動糖化血紅蛋白分析儀。

1.1.3 試劑 試劑（批號 EB－102S）、校準品（批號ZS0002）、質(zhì)控品（批號100842），均為原裝配套，由日本TOSOH公司提供。

1.2 方法 樣本檢測前均采用原公司提供的配套校準品進行校準，并用2個濃度水平的質(zhì)控品進行控制，結(jié)果在控，手工操作步驟嚴格按照《全國臨床檢驗操作規(guī)程》［2］進行。

1.2.1 精密度試驗

1.2.1.1 批內(nèi)試驗 選取新鮮全血樣本，含正常、異常濃度，分別測定HbA1c的含量，在一天內(nèi)重復(fù)測定20次，計算變異系數(shù)。

1.2.1.2 批間試驗 采用質(zhì)控品，含正常、異常濃度，分別測定HbA1c的含量，每天上下午各測定1次，連續(xù)測定10 d，計算變異系數(shù)。

1.2.2 準確度試驗 使用校準物在分析儀上連續(xù)進行10次分析，統(tǒng)計結(jié)果，計算結(jié)果均值與標定值的偏倚，偏倚應(yīng)小于或等于3.0%。

1.2.3 攜帶污染率 取高濃度全血樣本，混合均勻后連續(xù)測定3次，測定值分別為H1、H2、H3；再取低濃度全血樣本，連續(xù)測定3次，測定值分別為L1、L2、L3。按公式計算攜帶污染率（≤3.0%）。攜帶污染率＝（L1－L3）×100%／（H3－L3）。

1.2.4 線性試驗 （1）選取高值 HbA1c（18.1%）和低值HbA1c（4.7%）的人全血樣品。（2）吸取20μL的高值樣品注入樣品管，加入4 mL（200倍稀釋）溶血洗凈液配制成樣品A。（3）吸取20μL的低值樣品注進樣品管，加入4 mL（200倍稀釋）溶血洗凈液配制成樣品B。（4）在分析儀上測定樣品A和樣品B，根據(jù)打印結(jié)果分別確認兩個樣品的色譜峰總面積（Total Area），該總面積表示HbA1c的濃度。（5）調(diào)整總面積，使樣品A與樣品B的色譜峰總面積相近，此時調(diào)整后樣品B的濃度為4.6%。（6）按照100%、80%、60%、40%、20%、0%比例稀釋混勻（B為稀釋液），每個樣品檢測3次，對檢測結(jié)果的均值和預(yù)期值進行直線回歸統(tǒng)計。將實測值與理論值作比較（偏離應(yīng)小于10%），計算y＝a x＋b，驗證線性。（7）要求：a值在1±0.05范圍內(nèi)，相關(guān)系數(shù)r2≥0.95。

2 結(jié) 果

2.1 精密度試驗 見表1。

2.2 準確度試驗 見表2。

2.3 攜帶污染率 本次試驗驗證的攜帶污染率為1.09%，滿足要求（≤3.0%）。

2.4 線性試驗 將檢測結(jié)果的均值和預(yù)期值進行直線回歸統(tǒng)計。將實測值與理論值作比較（偏離應(yīng)小于10%），計算y＝a x＋b，其中a＝0.9832，r2＝0.9922，滿足要求（a值在1±0.05范圍內(nèi)，相關(guān)系數(shù)r2≥0.95）。

表1 精密度試驗

表2 準確度試驗－定值校準品

3 討 論

HbA1c水平反映的是在檢測前120 d內(nèi)的平均血糖水平，而與抽血時間、患者是否空腹等因素?zé)o關(guān)，是監(jiān)測糖尿病控制情況的良好指標［3］。

美國頒布的《臨床實驗室修正法案的最終法規(guī)》、ISO 15189醫(yī)學(xué)實驗室認可標準以及美國病理家學(xué)會（CAP）的認證標準［4-6］均要求實驗室對引進或改變的檢測系統(tǒng)進行性能驗證后方可用于常規(guī)工作。全自動糖化血紅蛋白分析儀HLC－723 G8基于高效液相色譜分析法的原理，通過陽離子交換柱利用電位差將血紅蛋白組分分離。利用3種不同濃度洗脫液使包括HbA1c在內(nèi)的多種血紅蛋白進行梯度分離，分離成6個部分。經(jīng)檢測器檢測分離后的各血紅蛋白組分的吸光度，以百分率形式表示出各血紅蛋白的組分結(jié)果與色譜圖。作者通過測定全血中HbA1c的含量，從以下幾個方面對該儀器性能進行綜合評價。

3.1 精密度 批內(nèi)變異系數(shù)小于1.0%，批間變異系數(shù)小于1.3%，符合CLIA′88對室間評估的允許誤差要求，1／4允許誤差范圍為批內(nèi)不精密度判斷限（≤3.0%），1／3允許誤差范圍為日間不精密度判斷限（≤4.0%），說明該儀器的重復(fù)性好，測定結(jié)果穩(wěn)定。

3.2 準確度評價 分析廠商提供的HbA1c校準品，用校準品校準后，連續(xù)重復(fù)測定該批號校準品10次，統(tǒng)計結(jié)果，計算檢測均值與標定值的偏倚，測試結(jié)果偏倚均小于3.0%，滿足要求，說明該儀器準確性高。

3.3 其攜帶污染率小于或等于3.0%，樣品間的交叉污染極小，滿足檢測要求。

3.4 通過線性試驗，可觀察各稀釋點均呈現(xiàn)較好線性，a值及r2均滿足要求，試驗所驗證項目的測量范圍符合線性。綜上所述，全自動糖化血紅蛋白分析儀HLC－723 G8精密度高、準確性好、交叉污染極小，且具有良好線性等優(yōu)點；另外，測試速度快、操作簡便。為臨床調(diào)整糖尿病治療方案提供準確依據(jù)，有很好的應(yīng)用前景。

［1］王笠，李琳.糖化血紅蛋白的檢測和臨床應(yīng)用［J］.上海醫(yī)學(xué)檢驗雜志，2003，18（2）：119－121.

［2］葉應(yīng)嫵，王毓三，申子瑜.全國臨床檢驗操作規(guī)程［M］.3版.南京：東南大學(xué)出版社，2006：223.

［3］紀立農(nóng)，寧光.糖化血紅蛋白［M］.北京：人民衛(wèi)生出版社，2010：2－16.

［4］魏昊，叢玉隆.醫(yī)學(xué)實驗室質(zhì)量管理與認可指南［M］.北京：中國計量出版社，2004：59－75.

［5］Department of Health and human Services，Centers for Medicare ＆ Medicaid Services.Clinical Laboratory improvement amendments of 1988：final rule［M］.Fed Register，2003：3704.

［6］畢波，呂元.定量檢測方法學(xué)性能驗證的系統(tǒng)設(shè)計［J］.中華檢驗醫(yī)學(xué)雜志，2007，30（2）：143－145.