實時熒光定量聚合酶鏈反應在肺結核診斷中的應用

毛文捷，鄒盛華，張麗水，黃明翔，戴臘梅（福建省福州市肺科醫院 350008）

實時熒光定量聚合酶鏈反應（FQ－PCR）技術于1996年由美國應用生物（Applied Biosystems）公司推出，較常規PCR（end－point PCR）不同，可在PCR指數擴增期間通過連續監測熒光信號強弱的變化來即時測定特異性產物的量，并據此推斷目的基因的初始量，不需要取出PCR產物進行分離。本院于2007年從美國Applied Biosystems公司引進該技術，應用于結核病的臨床診斷。本研究對189例臨床診斷肺結核患者的痰液進行FQ－PCR檢測、BACTEC 960培養和涂片抗酸染色，并對結果進行對比分析，探討FQ－PCR在肺結核診斷中的應用價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取本院2010年1月至2010年3月住院的經細菌學確診的肺結核患者189例，其中男102例，女87例，年齡18～75歲，平均33.8歲。其他肺部疾病患者94例，其中肺炎19例，非結核分枝桿菌肺病20例，支氣管擴張24例，肺癌31例。另取門診健康體檢者20例作為對照組，其中男女各10例，年齡20～55歲。

1.2 儀器與試劑 美國應用生物（Applied Biosystems）公司生產的ABI7300熒光定量擴增儀，結核分枝桿菌核酸擴增PCR熒光檢測試劑盒為中山大學達安基因股份有限公司生產，美國BD公司BACTEC 960全自動分枝桿菌檢測儀及配套試劑，奧林巴斯顯微鏡，抗酸染色液（自制）。質控菌株：結核分枝桿菌（ATCC27294）。

1.3 方法 189例肺結核患者采集早晨痰液標本3份，分別進行FQ－PCR檢測、涂片抗酸染色鏡檢及BACTEC 960培養。其他肺部疾病患者94例及健康體檢者20例采集晨痰標本1份進行A組實驗。

1.3.1 PCR檢測 （1）痰液中加入4倍體積的4%NaOH，搖勻，室溫下放置30min左右液化，取1.0 mL至離心管中，再加入0.5 mL 4%NaOH，室溫放置10min后15 000 r／min離心5min。去上清液，沉淀加無菌生理鹽水1 mL打勻，15 000 r／min離心5min，再重復一次，沉淀加50μL DNA提取液，置沸水浴10min。10 000 r／min離心5min，取上清液2μL做PCR。取單管單人份PCR反應管若干，加入處理后樣品2μL，8 000 r／min離心5 s。將各反應管放入PCR儀，按下列條件擴增：93℃2min；93℃45 s，55℃120 s，10個循環；置33℃保溫，迅速逐個將反應管放入熒光檢測儀，讀取并記錄讀數A0。熒光激發波長為487 nm，檢測波長為525 nm。最后按93℃45 s，55℃120 s，30個循環；置33℃保溫。（2）反應結束后保存檢測數據文件。根據分析后圖像調節baseline的start值（2～4）、stop值（7～9）以及Threshold值，最后到reporter窗口下記錄儀器自動分析計算出的Ct值。（3）結果判定。在實驗有效的前提下根據Ct值判定陰陽性，Ct值大于或等于30為陰性，Ct值小于30為陽性。

1.3.2 涂片抗酸染色 所有送檢的痰標本嚴格按照《結核病診斷細菌學檢驗規程》操作［1］，每份標本涂片3張，其中只要有1片為陽性即統計為陽性。

1.3.2 BACTEC 960培養 所有送檢的痰標本嚴格按照BACTEC 960操作規程，陰性報告時間設定為42 d。

1.4 統計學處理 使用SPSS13.0進行統計計算，采用χ2檢驗方法，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

189例肺結核患者的痰液FQ－PCR檢測陽性者123例，BACTEC 960培養陽性者120例，兩者同時陽性的為107例，FQ－PCR檢測陽性而BACTEC 960培養陰性為16例，PCR檢測陰性而BACTEC 960培養陽性為13例。涂片抗酸染色陽性76例，FQ－PCR和BACTEC 960培養均為陽性（表1）。94例其他肺部疾病患者及20例健康對照FQ－PCR檢測均為陰性，特異度為100.0%。

表1 3種方法檢測結果對比

3 討 論

PCR技術是一種先進的基因診斷方法，在肺結核的臨床診斷中也得到了廣泛應用。但是因為PCR污染問題而導致假陽性率高，一度引起人們的懷疑。自從1996年美國應用生物（Applied Biosystems）公司推出FQ－PCR技術，該技術不僅實現了PCR從定性到定量的飛躍，而且與常規PCR（end－point PCR）相比，它具有特異性更強、有效解決PCR污染問題、自動化程度高等特點［2］。

本研究采用FQ－PCR技術，利用一對結核分枝桿菌特異性引物和一條結核分枝桿菌特異性熒光探針，配以PCR反應液、耐熱DNA聚合酶（Taq酶）、4種核苷酸單體（d NTPs）等成分，用PCR體外擴增法檢測結核分枝桿菌DNA，做定量檢測，定性報告，使結果更準確。肺結核患者FQ－PCR檢測敏感度為65.1%（123／189），94例其他肺部疾病患者及20例健康對照FQ－PCR檢測均為陰性，提示特異度為100.0%。

結核病診斷的金標準是檢出痰液中的結核分枝桿菌，傳統的方法是痰培養發現結核分枝桿菌或痰涂片抗酸染色發現抗酸桿菌，FQ－PCR技術則是檢測痰液標本中結核分枝桿菌DNA的含量。FQ－PCR 敏感度最高為 65.1%（123／189），BACTEC 960培養法、涂片抗酸染色分別為63.5%（120／189）和40.2%（76／189）。FQ－PCR與抗酸染色比較差異有統計學意義（χ2＝23.44，P＜0.01），而與BACTEC960培養比較無統計學意義（χ2＝0.10，P＞0.05）。

FQ－PCR直接檢測痰液標本中結核分枝桿菌DNA的含量，敏感度和特異度均高，整個過程僅需4～5 h，出報告時間短，可以送檢當天出報告，在患者就診的當天就能確診，有利于患者的及時診斷和治療。BACTEC 960培養法敏感度高，但是培養周期較長，不利于結核病的早期發現和早期治療。李洪敏等［3］報道BACTEC 960培養法初代分離標本陽性報告平均時間為7.2 d，本實驗室略長，為8.9 d，陰性報告時間均設定為42 d。痰涂片抗酸染色簡單易行，出報告快，費用低廉，可以起到篩查的作用，缺點是陽性率低，易漏診。

3種方法均要求患者留取合格的痰液標本，以早晨痰液為最佳。操作者應取材恰當，挑取膿液或帶血部分，以避免選擇唾液部分。BACTEC 960培養要求及時送檢，不能及時處理的標本應低溫保存。由于BACTEC 960培養前處理的設計缺陷，不可避免導致一定的污染率。穆成等［4］報道BACTEC 960培養污染率為4.95%，高于改良羅氏培養基培養的2.12%。痰涂片抗酸染色也要求及時送檢，以避免痰液液化，影響陽性檢出率。而FQ－PCR直接檢測痰液標本中結核分枝桿菌DNA的含量，關鍵是DNA的提取過程，尤其是痰液或病理組織樣本均質化處理，對于標本送檢時間要求不高，不存在污染重送的問題。在結核分枝桿菌DNA提取過程中，為提高陽性檢出率，可在加入DNA提取液，置沸水浴10min后，轉至4℃靜置6～8 h，以保證充分裂解。

FQ－PCR技術因其極為有效可靠，而廣泛應用于分子生物學研究各領域。目前已經廣泛應用于結核病的臨床診斷中。適用于各種臨床標本中結核分枝桿菌DNA的直接檢測，包含血液標本。而BACTEC 960培養和涂片抗酸染色則不適用于血液標本。黃瑋和張永樂［5］報道應用熒光定量PCR檢測結核分枝桿菌在支氣管灌洗液中檢出率最高，其次為痰液，檢出率最低為血液。有條件的醫院最好在支氣管鏡下直接從病變的病灶部位取得標本，可以提高檢出率。此外，還可用于分枝桿菌菌種快速鑒定及抗結核藥耐藥基因的快速檢測等［6］。

綜上所述，作者認為FQ－PCR技術具有快速、準確、特異性強、陽性率高、需時短、縮短了結核菌的檢測時間等獨特的優點，為結核病的快速診斷提供了更有效的手段，為早期治療提供有效支持。

［1］中國防癆協會.結核病診斷細菌學檢驗規程［J］.中國防癆雜志，1996，118（1－3）：30－33，80－85，127－134.

［2］李加平.熒光定量聚合酶鏈反應在淋巴結結核鑒別診斷中的應用［J］.檢驗醫學與臨床，2011，8（1）：67－68.

［3］李洪敏，吳雪瓊，王巍，等.新型BACTEC MGIT 960全自動快速分枝桿菌培養鑒定藥敏儀及其應用［J］.現代科學儀器，2000，16（2）：61－62.

［4］穆成，趙德福，趙慧，等.應用BACTEC 960系統與改良羅氏培養基從肺外標本分離培養分枝桿菌的效果比較［J］.中國衛生檢驗雜志，2009，19（11）：2579－2580.

［5］黃瑋，張永樂.肺結核分枝桿菌在不同標本類型中的分布［J］.醫學研究雜志，2009，38（3）：75－76.

［6］白廣紅，梁雅萍，朱蕾.BACTEC MGIT 960 system快速分離結核桿菌的效果評價［J］.實用醫技雜志，2006，13（18）：3187－3188.