胎豬脫細胞主動脈作為小口徑組織工程血管替代物的體內試驗研究

[摘要]目的：研究胎豬脫細胞主動脈（decellularized aorta of fetal pigs，DAFP）的生物相容性，確定其是否有作為支架材料用于小口徑組織工程血管移植的潛力。方法：利用胰酶和核酸酶聯(lián)合的脫細胞方法來制備胎豬主動脈脫細胞基質(DAFP)，將其作為小口徑組織工程血管的生物支架材料移植在成年犬單側頸總動脈處，并監(jiān)測其移植處的血流通暢情況，后期又通過組織學染色觀察組織工程血管的組織學結構；掃描電鏡觀察血管的內表面結構；透射電鏡觀察其內表面的內皮細胞再生情況。結果：組織學染色結果表明構建的小口徑組織工程血管具有完整的內膜層及中膜層結構；掃描電鏡結果顯示組織工程血管內表面覆蓋著完整的內皮細胞層。結論：DAFP有作為小直徑組織工程血管支架用于體內移植的潛力。

[關鍵詞]組織工程；血管移植；生物支架材料；細胞外基質

[中圖分類號]R318 [文獻標識碼]A [文章編號]1008-6455（2012）05-0773-03

The vivo study on decellularized aorta of fetal figs can be substituted for tissue engineered small-diameter blood vessel

ZHANG Ying-bo，LIU Guo-feng，LI Qing-chun，YANG Da-ping

(Department of Plastic Surgery，The Second Affiliated Hospital of Harbin Medical University，Harbin 150086，Heilongjiang，China)

Abstract: Objective To study the biocompatibility of the DAFP，determining it weather have a potential as a scaffold of tissue engineered small-diameter blood vessel graft. Methods Carotid artery of fetal pig was removed cells by using Trypsin／EDTA，ribonuclease and desoxyribonuclease.Afterward， we transplanted the DAFP into unilateral carotid artery of 6 adult dogs individually.Both the DAFP and the tissue which have been transplanted were evaluated with Hematoxylin and Eosin (HE) staining，scanning electron microscopy and transmission electron microscopy. Results H＆E staining and electron microscopy confirmed that carotid arteries have intact monolayer endothelial cells. Conclusion Decellularized aorta of fetal figs have the ability to substitute for further small-diameter vascular tissue engineering.

Key words:tissue engineering， vascular graft， biological scaffold， extracellular matrix

動脈粥樣硬化及周圍血管疾病是世界范圍內危害人類健康的主要疾病， 并且發(fā)病率逐年上升[1]，病情嚴重的患者常需要通過小口徑血管(內徑<6mm)移植的手段進行外科手術治療。自體靜脈或者動脈（如：大隱靜脈、內乳動脈等）是最好的替代物，但是約有30%的患者因缺少合適的自體血管，而必須采用組織工程血管來替代移植。在血管組織工程研究中，支架材料是組織工程構建血管的基本要素之一，包括高分子可生物降解聚合物材料和脫細胞生物材料[2]，在生物相容性和適宜的生物力學性質方面脫細胞生物材料明顯優(yōu)于高分子可生物降解聚合物材料，生物材料中經過脫細胞處理的異體血管基質很好地去除了抗原性， 移植后與受體細胞有較好的相容性[3-4]，因此也更適合用于小口徑血管的高張力、低血流的特殊狀態(tài)[5]，從而達到減少術后急性血栓、新內膜增生、動脈瘤形成、感染等病變發(fā)生的目的，有效地增加了移植血管的通暢率。本實驗利用胰酶和核酸酶聯(lián)合的脫細胞方法制備DAFP，將其作為小口徑組織工程血管的生物支架材料，并在以往的實驗中充分的驗證這一組織工程血管支架材料的組織學特性及生物力學性質[6]。為了逐步向臨床過渡提供可靠的依據(jù)，筆者進一步進行了動物模型的體內實驗觀察，將該脫細胞組織工程血管支架材料移植在成年犬單側頸總動脈處并監(jiān)測其存活狀況，在確定組織工程血管內血流通暢；周圍血腫基本吸收后，二次手術取出移入的組織工程血管，并進行組織學監(jiān)測和電鏡觀察。

1 實驗步驟

所有動物實驗操作均在遵循實驗動物保護及使用指南的指導下進行。

1.1組織的獲取：實驗所需的組織來源于當?shù)剌^近的屠宰場，在無菌條件下取出新鮮的胎豬（頂臀長25～30cm的孕末期胚胎[7]）降主動脈，并置于冰凍生理鹽水中運至實驗室，這一轉運方式保證了熱缺血時間不超過30min。在清除脂肪和貼壁組織后，用無菌冷生理鹽水對主動脈進行徹底沖洗，再將動脈組織經過下述的處理過程，準備成主動脈支架。

1.2主動脈支架的制備：利用胰蛋白酶和核酸酶連續(xù)消化方法制備DAFP，首先用0.1%胰蛋白酶+0.02%乙二胺四乙酸 (EDTA)溶液消化20h，每10h更新消化液;大量磷酸緩沖鹽溶液(PBS)沖洗后，再用20μg/ml核糖核酸酶(RNase)+200μg/ml脫氧核糖核酸酶(DNase)溶液（溶液均來自：德國，勃林格，曼海姆）消化4h，大量PBS沖洗。以上消化過程均是在37℃、5%CO2、95% 空氣及持續(xù)振蕩條件下進行的。在處理前后取材檢測，通過DNA定量分析和HE組織學染色評價細胞及細胞碎片的去除情況，使細胞DNA殘留量少于0.1%。制備出長約22mm的脫細胞血管基質材料如圖1、2，取部分支架材料分別置于10%中性甲醛溶液中和1%戊二醛溶液中，為后期的組織學染色和電鏡觀察做準備。

1.3 Ⅰ期手術：支架材料的受體為2歲半成年雜種家犬6只，雌雄不限，體重25～30kg。實驗動物經常規(guī)麻醉后，取仰臥位四肢伸展并固定，頸部剔毛，常規(guī)消毒鋪巾；依據(jù)組織工程血管的長度，于無菌條件下離斷等長的犬單側頸總動脈(如圖3)，并用肝素反復沖洗斷端；將血管支架在生理鹽水浸泡約5min后，通過端端吻合術將血管支架移植入頸總動脈處(如圖4)。術后3天進行抗生素治療，防止術后感染和瘺管的形成。

1.4 術后觀測：移植術后觀測手術區(qū)域有無出血及血腫形成，動物有無發(fā)熱、呼吸急促等生命體征的變化，并給予及時的處理。術后定期觀察實驗動物的生存狀態(tài)，分別于術后10天、1個月，3個月及6個月的時期利用彩色多普勒進行血流通暢度的觀測。

1.5 Ⅱ期手術：在確定移植入的血管支架已基本被宿主所接納（無明顯排斥反應）；血流通暢度良好；支架與正常血管的吻合處管壁內表面光滑后(約6個月后)，再次手術取出移植處的血管組織。術前準備同Ⅰ期手術；在原切口附近再次切開，剝離粘連組織，并切取移植入的支架血管和兩端少許正常血管組織（頸總動脈處兩個殘留的斷端直接進行結扎止血）；立即用肝素沖洗管腔，再將組織置于生理鹽水中清洗；沿縱軸小心地將管腔剖開，再分別將組織置于10%中性甲醛和1%戊二醛溶液中4℃條件下保存，為下一步的組織學染色及電鏡觀察做準備。

1.6 組織學染色：將標本置于10%中性甲醛溶液中固定24h，常規(guī)石蠟包埋、切片，進行HE染色。在光學顯微鏡下對標本的結構進行組織學評價。

1.7 電鏡觀察：將標本在1%戊二醛溶液中固定24h，之后用1%鋨酸作后固定2h;50%、70%、90%、100%丙酮梯度脫水，每級10min；50%、70%、90%、100%醋酸異戊酯置換， 每級10min;應用臨界點干燥儀、液體CO2等進行干燥；干燥的標本固定在鋁質標本臺上，用濺射鍍膜機鍍金后，用掃描電鏡系統(tǒng)觀察并照相。透射電鏡樣本先用0.1%戊二醛和0.16mmol/L的二甲砷酸鈉緩沖液預固定30min，而后2%戊二醛固定2h。經標準的鋨化處理和包埋后，用透射電鏡進行觀察。

2 實驗結果

2.1 大體觀察：Ⅱ期手術取出的血管支架內表面光滑、管壁有彈性、與吻合口兩端正常頸總動脈的管壁結構相似。

2.2 組織學觀察：標本HE染色顯示，圖5A、C為脫細胞處理后的組織工程血管，如圖清晰可見其細胞成分已被完全脫除，細胞外基質成分保存完整，血管內彈性膜連續(xù)完整。圖5B、D為經過體內移植后的組織工程血管，官腔光滑，內表面形成一層連續(xù)完整的血管內皮細胞，細胞核深染(見圖5D)，外層為纖維蛋白膠與平滑細胞的混合層，纖維蛋白膠在鏡下表現(xiàn)為均質致密的結構，內部有少量的單個平滑肌細胞，同時可見纖維蛋白膠層與血管脫細胞基質結合緊密，沒有明顯的分離現(xiàn)象(見圖5B)。

2.3 電鏡觀察：掃描電鏡下可見移植后的組織工程血管的內表面已有內皮細胞覆蓋，細胞之間結合緊密，內皮細胞間顯露有脫細胞基質的纖維結構(圖6B)。圖6A，顯示了未用于移植的組織工程血管內表面疏松的三維結構。圖6C，為透射電鏡下緊密連接的內皮細胞結構。

3 討論

血管組織工程研究的支架材料主要分為兩大類:生物支架材料和可降解高分子聚合物材料[8]。高分子聚合物材料可以在體內完全降解，理化性質可以人為控制，生產重復性好。但聚合物材料最大的不足之處是其生物相容性差，降解產物對細胞的生物學及新組織形成有多方面的不利影響[9]。生物支架材料主要由細胞外基質成分構成， 具有增加細胞黏附及新組織形成的生物學信號， 具有良好的體內外生物相容性[10]。血管組織工程支架材料的發(fā)展趨勢將會是大量自然生物材料的應用，其中血管脫細胞基質材料具有理想的形態(tài)和生物相容性，逐漸成為血管組織工程研究的重要支架材料[11]。人源性生物材料的供應不足使人的同種異體血管脫細胞基質支架材料應用受到極大的限制，由于學者們發(fā)現(xiàn)，一定胎齡胚胎動物的某些組織具有較低的免疫原性，所以在當今人類異種器官移植領域研究中，豬的胚胎已成為人類器官組織移植研究的首選來源。本實驗中采用的孕末期胎豬主動脈脫細胞基質(DAFP)材料具有極低的異種免疫原性、適當?shù)纳锪W性質以及良好的體內外生物相容性[6]，為進一步證明該材料的體內相容性，筆者將其成功地移植入家犬的頸總動脈處，并檢測出支架血管的內表面有大量連續(xù)的內皮細胞覆蓋。

綜上所述，本實驗為異種生物材料應用于人類小口徑血管組織工程研究提供嶄新的思路，也為DAFP材料的臨床應用研究提供理論與實踐依據(jù)。

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[收稿日期]2011-11-17 [修回日期]2012-02-22

編輯/張惠娟