人瘢痕角質(zhì)形成細(xì)胞原代培養(yǎng)中胰酶配方及濃度的探討

[摘要]目的：研究不同配方及濃度的胰蛋白酶對(duì)人瘢痕角質(zhì)形成細(xì)胞（Keratinocyte，K）生物活性影響。探索一種更適于瘢痕角質(zhì)形成細(xì)胞原代培養(yǎng)消化的方法。方法：溫消化法分離瘢痕組織表皮、真皮后，分別采用0.1%胰蛋白酶和0.05%胰蛋白酶-0.025%EDTA對(duì)表皮片進(jìn)行消化，培養(yǎng)角質(zhì)形成細(xì)胞，用臺(tái)盼藍(lán)染色法和24h細(xì)胞貼壁率觀察K存活率及細(xì)胞活性。結(jié)果：兩種配方胰酶消化K，細(xì)胞存活率均達(dá)80%以上，結(jié)果無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。與單獨(dú)使用胰蛋白酶相比，經(jīng)胰蛋白酶-EDTA組消化后的細(xì)胞貼壁率增加，結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。結(jié)論：胰蛋白酶-EDTA能較溫和地消化角質(zhì)形成細(xì)胞，較大程度地保留細(xì)胞活性，與胰蛋白酶消化法相比，此方法更適合K的消化及培養(yǎng)。

[關(guān)鍵詞]角質(zhì)形成細(xì)胞；胰蛋白酶；乙二胺四乙酸

[中圖分類號(hào)]Q813.1 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A [文章編號(hào)]1008-6455（2012）05-0762-02

Effect of different digestion methods on the hypertrophic scar derived keratinocytes culture

JIANG Cai-li，NONG Xiao-lin

(Department of Oral and Maxillofacial Surgery，College of Stomatology，Guangxi Medical University，Nanning 530021，Guangxi，China)

Abstract: Objective To research the effect of different digestion methods acted on keratinocytes and obtain a better one. Methods Cultured keratinocytes derived from hypertrophic scar using digestion 0.1% trypase and 0．05% trypase with 0.025% ethlenediamine tetracetic acid (EDTA)．Cell vigor was observed with teypane blue stained and calculated the adherence rate in 24 hours. Results Keratinocytes digested by different trypase showed over 80%survival rate．However，a significant difference was found on adherence rate in 24 hours (P＜0.05). Conclusion Digestion with 0．05% trypase mixed 0. 025% EDTA was better for cultivation of keratinocyte compared with 0.1%trypase using alone.

Key words:Keratinocyte；Trypase；EDTA

在瘢痕研究中，筆者比較了兩種不同的消化酶在培養(yǎng)原代瘢痕角質(zhì)形成細(xì)胞時(shí)的效果，報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑：胰蛋白酶、DMEM、角質(zhì)形成細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基（K-SFM）、含100U／ml青霉素、100 mg／ml鏈霉素雙抗，購(gòu)自Gibco公司。胎牛血清（FCS），購(gòu)自Hyclone公司。乙二胺四乙酸（EDTA），購(gòu)自Sigma公司。DispaseⅡ，購(gòu)自ROCHE公司。臺(tái)盼藍(lán)染色細(xì)胞存活率檢測(cè)試劑盒（購(gòu)自BOSTER公司）。

1.2 標(biāo)本來(lái)源：均來(lái)自于廣西醫(yī)科大學(xué)整形外科行瘢痕整復(fù)術(shù)的患者，取材局部未使用瘢痕抑制藥物，不伴有腫瘤或其他嚴(yán)重疾病。取材前經(jīng)患者知情同意。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 瘢痕角質(zhì)形成細(xì)胞的分離與培養(yǎng)：手術(shù)切除的瘢痕標(biāo)本保存于含有500U/ml青霉素和500mg/ml鏈霉素的PBS中，4℃無(wú)菌條件下運(yùn)送到超凈工作臺(tái)，取出標(biāo)本，75%酒精浸泡30s，以含100U/ml青霉素和100mg/ml鏈霉素的PBS反復(fù)漂洗5次，剪棄皮下脂肪及結(jié)締組織。將皮膚瘢痕修剪為3mm×20mm長(zhǎng)條狀，移入DispaseⅡ(2.4U/ml)中，37℃ 3h。從瘢痕組織中剝離表皮片，分別放入含0.1%胰蛋白酶的PBS消化液中，37℃培養(yǎng)箱中10min，輕柔吹打5min，和已預(yù)熱至37℃含0.05%胰蛋白酶-0.025%EDTA的PBS消化液中，輕柔吹打5min。加入等體積含10%FCS的DMEM培養(yǎng)液中止消化，200目不銹鋼篩網(wǎng)過(guò)濾，1 000rpm離心10min，棄上清收集細(xì)胞，培養(yǎng)基洗脫兩次，以K-SFM重懸沉淀成均勻細(xì)胞懸液。實(shí)驗(yàn)分為：0.1%胰蛋白酶消化組和0.05%胰蛋白酶-0.025%EDTA消化組，每組設(shè)5個(gè)副孔比較。

1.3.2 臺(tái)盼藍(lán)染色檢測(cè)細(xì)胞存活率：收集細(xì)胞懸液，離心1 000rpm，1min，以細(xì)胞稀釋液調(diào)整細(xì)胞密度為1×106/ml，重懸細(xì)胞，將100μl細(xì)胞懸液和100μl 0.4%臺(tái)盼藍(lán)染色液輕輕吹打混勻，3min后滴板計(jì)數(shù)500個(gè)細(xì)胞，未著色者為活細(xì)胞，著藍(lán)色者為死細(xì)胞。計(jì)算方法：細(xì)胞存活率（%）＝活細(xì)胞數(shù)/500×100% 。

1.3.3 細(xì)胞貼壁率：取細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為1×104/ml，接種入24孔板，每孔1ml，置于37℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中，24h后取出，棄培養(yǎng)液。每孔加入0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA 0.5ml，37℃溫箱中消化5～10min，以等量含10%FCS的DMEM培養(yǎng)液終止消化。1 000rpm離心10min，加入K-SFM混懸細(xì)胞，取細(xì)胞懸液計(jì)數(shù)。貼壁率（%)=（貼壁細(xì)胞數(shù)/接種細(xì)胞數(shù))×100%。

1.3.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 13.0，樣本率的比較采用χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 采用胰蛋白酶和胰蛋白酶-EDTA，消化角質(zhì)形成細(xì)胞，鏡下觀察細(xì)胞呈圓形，大小相似，輪廓清晰，胞漿透亮，胞核較大而清晰。臺(tái)盼藍(lán)染色活細(xì)胞計(jì)數(shù)均﹥80%（見(jiàn)表1），兩組胰酶對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞活力的影響無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P﹥0.05）。

2.2 角質(zhì)形成細(xì)胞以K-SFM作為培養(yǎng)基，置于37℃5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。胰蛋白酶消化組細(xì)胞培養(yǎng)6h見(jiàn)少量細(xì)胞貼壁，10h后貼壁細(xì)胞稍有增加，24h后仍有60%的細(xì)胞未貼壁，貼壁后細(xì)胞由圓形變?yōu)椴灰?guī)則多角形，細(xì)胞邊界尚清，胞漿內(nèi)可見(jiàn)少量空泡和較多顆粒，細(xì)胞活性較差。胰蛋白酶-EDTA消化組細(xì)胞培養(yǎng)4h則可見(jiàn)較多細(xì)胞貼壁，8h后50%的細(xì)胞都已貼壁，24h后貼壁細(xì)胞超過(guò)70%。貼壁后細(xì)胞很快變?yōu)椴灰?guī)則多角形，輪廓清晰，胞漿清亮，呈現(xiàn)活躍的生長(zhǎng)態(tài)勢(shì)（見(jiàn)表2）。不同配方及濃度胰酶消化角質(zhì)形成細(xì)胞，對(duì)細(xì)胞貼壁率的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

3 討論

從皮膚結(jié)構(gòu)方面，真表皮連接包括基底層角質(zhì)形成細(xì)胞基底面借半橋粒與基底膜連接，而相鄰角質(zhì)形成細(xì)胞間為橋粒連接。目前，在角質(zhì)形成細(xì)胞的原代培養(yǎng)中，分離表、真皮通常使用胰蛋白酶或中性蛋白酶[1]。胰蛋白酶是胰酶的一種，通過(guò)水解細(xì)胞間的蛋白質(zhì)為多肽，而使細(xì)胞離散，這種分散細(xì)胞的特性依據(jù)其作用的組織和細(xì)胞、濃度、溫度及時(shí)間的不同而改變，消化過(guò)度往往造成細(xì)胞損傷。中性蛋白酶DispaseⅡ主要分解Ⅳ型膠原和纖維粘連蛋白[2]，選擇性地作用于半橋粒，使真、表皮間的連接松散，易于分離，對(duì)細(xì)胞不造成損傷。胰蛋白酶短時(shí)間的作用于角質(zhì)形成細(xì)胞，不至于使其死亡，因此，細(xì)胞的存活率較高。胰蛋白酶能從蛋白質(zhì)上去除帶正電荷的氨基酸，而細(xì)胞的貼壁率與其表面所攜帶的電荷是有關(guān)的。EDTA是2價(jià)陽(yáng)離子螯合劑，能螯合鈣離子，而角質(zhì)形成細(xì)胞間連接所需的橋粒的形成依賴于鈣離子的存在。因此，胰蛋白酶與EDTA的聯(lián)合使用，可以破壞細(xì)胞的橋粒結(jié)構(gòu)，解除細(xì)胞的接觸抑制，使細(xì)胞分散成單個(gè)細(xì)胞，明顯提高角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖能力，同時(shí)減少了胰蛋白酶的作用濃度和時(shí)間，間接地增加了細(xì)胞貼壁率，提高了角質(zhì)形成細(xì)胞原代培養(yǎng)的成功率。此外，GIBCO公司近年研發(fā)的角質(zhì)形成細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)液(K-SFM)添加促角質(zhì)形成細(xì)胞生長(zhǎng)的物質(zhì)，有利于細(xì)胞的貼壁、增殖[3-4]，同時(shí)最大限度的限制了成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)，不失為一種簡(jiǎn)便易行，安全適用的理想方法。由于個(gè)體及損傷因素的不確定性，瘢痕組織的表現(xiàn)形態(tài)及組織特點(diǎn)也具有差異性（如患者年齡、瘢痕形成時(shí)間、程度等），仍然需要根據(jù)實(shí)驗(yàn)的具體情況作出相應(yīng)的調(diào)整。

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[收稿日期]2012-01-11 [修回日期]2012-03-15

編輯/張惠娟