當歸水煎液對人臍靜脈內皮細胞增殖、凋亡及膠原合成的影響

[摘要]目的：探討當歸水煎液對人臍靜脈內皮細胞增殖、凋亡和膠原合成的影響。方法：體外培養人臍靜脈內皮細胞，用噻唑藍比色法檢測細胞增殖活性，用流式細胞術分析細胞周期及凋亡，用放射免疫法測定膠原合成。結果：當歸水煎液能促進人臍靜脈內皮細胞的增殖，且隨濃度增大促增殖作用愈大。當歸水煎液使S期和G2/M期細胞增多，G0/G1期細胞減少（P<0.05)，凋亡率逐漸減小（P<0.05)。當歸水煎液呈劑量和時間依賴性抑制人臍靜脈內皮細胞合成膠原 (P<0.05)。結論：當歸水煎液呈劑量依賴性促進人臍靜脈內皮細胞的增殖，抑制其凋亡，減少膠原合成。

[關鍵詞]當歸水煎液；內皮細胞；增殖；凋亡；膠原合成

[中圖分類號]Q813.1 [文獻標識碼]A [文章編號]1008-6455（2012）05-0782-03

Effect of angelic decoction on proliferation， apoptosis， collagen synthesis of human umbilical vein endothelial cells

LIU Kai，ZHANG Xuan-fen，ZHANG Jin，QIN Yong-hong，ZHONG Lin

(Plastic Surgery，The Second Hospital of Lanzhou University，Lanzhou 730030，Gansu，China)

Abstract Objective To investigate the effects of angelic decoction on proliferation， cell cycle， apoptosis， and collagen synthesis of human umbilical vein endothelial cells (HUVEC). Methods HUVEC was cultured and passaged in Dulbecco's modified Eagle's medium(DMEM) and treated with Angelicanaphtha 1mg/L， 4mg/L， and 16mg/L at 1， 3， 5， and 7day respectively. The proliferation was measured with MTT method. The cell cycle and apoptosis were analyzed with Flow cytometry and collagen synthesis was determined with radioimmunoassay. Results The HUVEC proliferation was accelerated by Angelic decoction in concentration-dependent manner (P<0.05). S phase cells and G2/M phase cells were increased and G0/G1 phase cells and apoptosis was gradually reduced by Angelic decoction (P<0.05). The collagen synthesis of HUVEC was also inhibited by Angelic decoction in concentration-dependent manner (P<0.05). Conclusion The HUVEC proliferation was accelerated and the apoptosis was reduced and the collagen synthesis was reduced by Angelic decoction.

Key words:angelic decoction; endothelial cells; proliferation; apoptosis; collagen synthesis

創面愈合和瘢痕形成是新血管形成的結果[1]，內皮細胞增殖和合成細胞外基質是血管形成的基礎， 臍靜脈內皮細胞是調控血管形成的最佳靶點之一[2-3]。研究表明，當歸揮發油對人臍靜脈內皮細胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVEC)的增殖呈小劑量刺激、大劑量抑制的雙向調節作用，對膠原合成呈抑制效應[4]。然而，當歸水煎液對人臍靜脈內皮細胞增殖、凋亡和膠原合成的影響未見報道。我們的研究旨在探討當歸水煎液對創面愈合和瘢痕形成的作用。

1 材料和方法

1.1材料

1.1.1 主要試劑：高糖DMEM細胞培養基(Gibco公司) ，胎牛血清(中美合資蘭州民海生物工程有限公司) ，胰蛋白酶（Amresco公司），EDTA（西安化學試劑廠），吐溫-80(上海大眾制藥廠，批號:700934) ，MTT(華美生物技術公司) ，二甲基亞砜（北京亞太精細化工公司），碘化丙啶（Sigma公司），兔抗人Ⅷ因子相關抗原多克隆抗體(Santa Cruz公司 ），Ⅲ型前膠原氨端肽(Procollagen Ⅲ N-terminal peptide，PⅢNP）放射免疫分析試劑盒(北方生物技術研究所) 。

1.1.2儀器：Olympus倒置相差顯微鏡(日本Olympis公司)，Olympus萬能倒置相差顯微鏡(日本Olympis公司)，Olympus顯微鏡(日本Olympis公司)，層流超凈工作臺（蘇州凈化設備廠），SHEL.2300 CO2恒溫孵育箱(日本Sanyo公司)， 流式細胞儀(美國BD公司，FACScan)，Wellscan MK2型酶標儀(英國Labsystems dragon)，Sanyo冰箱（日本Sanyo公司），TJL-16B型離心機（上海靜安亭科學儀器廠）。

1.2 方法

1.2.1細胞培養及鑒定：細胞培養參照Jaffe[5]方法。取人新鮮臍帶，采用膠原酶臍靜脈灌流消化法分離HUVEC，接種于含有20%胎牛血清(FBS)、青霉素105 U/l、鏈霉素100mg/L的DMEM液，37℃5%CO2飽和濕度培養。細胞融合后，用胰蛋白酶消化傳代，實驗選用第3～5代細胞。臺盼藍染色細胞活性在95%以上，經Ⅷ因子相關抗原免疫細胞化學鑒定陽性[6-7]，倒置顯微鏡下觀察細胞呈鵝卵石狀排列，證實所培養細胞為內皮細胞。

1.2.2 藥物制備及分組：當歸購自甘肅岷縣，經蘭州大學生藥教研室馬志剛教授鑒定確認為傘形科植物當歸的根。當歸水煎煮3次，并濃縮至含生藥1g/ml。0 22μｍ微孔濾膜過濾除菌，4℃保存備用。實驗最大濃度為24h細胞半數致死量的1/4。實驗分4組：用DMEM配成終濃度為100mg/L、400mg/L、1 600mg/L的當歸水煎液，對照組用DMEM培養液。

1.2.3 細胞生長曲線測定：取對數生長期的血管內皮細胞以1×105個/ml的密度接種于96孔培養板中，常規培養24h后，按分組給藥。分別于孵育1、3、5、7天后常規消化細胞，于低倍鏡下計數細胞，然后計算每毫升細胞數三次，取平均值。繪制細胞生長曲線。

1.2.4 細胞增殖檢測：用噻唑藍(Methyl thiazolyl tetrazolium， MTT)染色法檢測細胞增殖。內皮細胞懸液（1×105個/ml）接種于96孔培養板，80%DMEM+20%FBS的培養液37℃ 5%CO2飽和濕度培養24h后，按分組給藥，繼續培養48h后，每孔加入MTT溶液(5mg/ml)20μl，37℃繼續孵育4h，終止培養，棄去培養液，加入DMSO 150μl/孔，振蕩10min，使結晶物充分溶解。酶標儀上490nm波長下測各孔光吸收值(OD)，每組8復孔。試驗重復2次。按下列公式計算促增殖率：促增殖率＝（當歸組OD值－對照組OD值）∕（對照組OD值－培養液組OD值）×100%。

1.2.5 細胞周期及凋亡檢測：用流式細胞術（Flow cytometry， FCM）檢測細胞周期及凋亡。取對數生長期的內皮細胞，不含胎牛血清的DMEM培養24h后，分別加入不同濃度當歸水煎液的DMEM培養48h。對照組加等體積的DMEM。常規消化離心細胞，PBS洗3次，以預冷的70%乙醇4℃固定過夜，RNA酶37℃消化30min，碘化丙啶(PI)染色后上流式細胞儀檢測各組細胞中DNA，每個樣品至少測定10 000個細胞以上。試驗重復2次。

1.2.6 膠原合成測定：用放射免疫法測定培養上清液中的Ⅲ型前膠原。取融合生長良好的內皮細胞，不含胎牛血清的DMEM培養24h后，分別加入不同濃度當歸水煎液的DMEM培養48h。對照組加等體積的DMEM。分別于12h、24h、48h后吸取培養上清液，-20℃保存，2周內檢測。

采用Ⅲ型前膠原氨端肽(PⅢNP）放射免疫分析盒檢測Ⅲ型膠原纖維的合成。檢測時，于1.5ml離心管中加入上清液100μl和兔PⅢNP抗體200μl，4℃放置20h，加125I-PⅢNP100μl，充分搖勻4℃放置4h，加驢抗兔免疫分離劑500μl，充分搖勻，室溫放置20min，4000r/min離心30min，吸棄上清液，在γ計數器測定各個沉淀管的放射活性。重復測定2次，取平均值。

1.2.7 統計學處理：計量資料以均數±標準差表示。用單因素方差分析比較組間差異顯著性。應用SPSS10.0 軟件包處理。P<0.05 為差異有顯著性。

2 結果

2.1 不同濃度的當歸水煎液對HUVEC生長的影響：隨著培養時間延長，各組均顯示出不同程度的促生長效應。1 600mg/L的當歸水煎液促生長效應最明顯，見圖1。

2.2 不同濃度的當歸水煎液對HUVEC增殖的影響：各組均有促增殖作用，隨著濃度增大促增殖效果愈加明顯，見表1。

2.3 不同濃度的當歸水煎液對HUVEC周期和凋亡的影響：給予不同濃度的當歸水煎液干預后，HUVEC周期各時相的細胞數占細胞總數的百分比與對照組比較有明顯的不同，S 期和G2/M期細胞增多， G0/G1期細胞減少，提示當歸水煎液濃度增大可促進內皮細胞DNA的合成，加快細胞增殖（P<0.05)，凋亡率逐漸減小，見表2。

2.4 不同濃度的當歸水煎液對HUVEC膠原合成影響：隨當歸水煎液濃度增加和作用時間延長，當歸水煎液對HUVEC培養上清液PⅢNP的濃度呈抑制作用（P<0.05），見表3。

3 討論

創傷愈合過程中血管內皮細胞具有重要作用。創傷后形成的肉芽組織的主要成分是成纖維細胞和毛細血管，新生的毛細血管則是由鄰近毛細血管內皮細胞分裂增生演變而來。血管內皮細胞功能與血管內皮生長因子（VEGF）密切相關，VEGF是一種強效的血管生成促進因子，具有強烈的促進內皮細胞增殖作用，能增加細胞外基質合成和促進血管生成。當歸促進HUVEC增殖，其機理可能是促進內皮細胞上VEGF的高表達[8]、增加內皮細胞周期中的S期和G2/M期而發揮作用。

中藥當歸為傘形科植物當歸的根，有活血化瘀、軟堅散結等功效。當歸活性成分分為揮發油和水溶性兩大部分，揮發油主要為抑制性成分，水溶性部分為興奮性成分[9-11]。王保華[12]報道當歸水煎液及其主要成分阿魏酸鈉能促進內皮細胞增殖。我們的實驗驗證了上述觀點，并發現當歸水煎液促進內皮細胞增殖隨濃度的增大而增強。

我們發現當歸水煎液可劑量依賴性及時間依從性地抑制HUVEC合成膠原。有實驗表明當歸注射液能拮抗大鼠氣管內注入博萊霉素誘導的肺纖維化[13]，可顯著降低四氯化碳誘導的大鼠肝纖維化模型的血清Ⅲ型前膠原水平[14]，可抑制成纖維細胞合成膠原[15]。這些結果均支持當歸水煎液可用于防治增生性瘢痕。當歸水煎液抑制HUVEC膠原合成的機制可能以下兩個方面：①可能與其能有效抑制膠原蛋白交聯、透明質酸解聚和脂質過氧化[16]；②通過降低TGFβ1表達來抑制膠原合成[17]。

本次實驗以人HUVEC為靶細胞，證明當歸水煎液可以促進HUVECB的增殖、抑制細胞凋亡及膠原合成從而發揮抗纖維化的作用。為當歸治療增生性瘢痕（HS）提供了實驗基礎。

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[收稿日期]2011-12-26 [修回日期]2012-03-09

編輯/張惠娟