10類食品污染阪崎腸桿菌狀況的調查研究

【摘要】 目的 了解10類食品中阪崎腸桿菌的污染狀況及污染數量，評估其風險性，為預防和控制阪崎腸桿菌的感染、傳播、流行提供科學依據。方法 按照GB4789.1-2010采抽樣技術、GB4789.40-2010《食品微生物學檢驗阪崎腸桿菌檢驗》、實時熒光PCR法操作規程，對10類850份食品進行阪崎腸桿菌檢驗，標準菌株作對照。結果 檢出阪崎腸桿菌54株，總檢出率為6.4%。該10類食品阪崎腸桿菌的檢出率差異有統計學意義，由高至低排序為：冰淇淋＞巧克力堅果＞熟肉＞糖餅類＞面包糕點＞方便面＞奶類＞飲用水、生肉、調味品。染菌量＞30 MPN/100g(ml)以上的有15份，占27.7%(15/54)。結論 10類食品檢出阪崎腸桿菌的有7類，應予以重視。

【關鍵詞】 阪崎腸桿菌； 定性； 定量

Investigation of 10 kinds of food be poluted by Enterobacter sakazakii LU Xing-er，ZHENG Yue-kang，WU Can-quan.Zhongshan Center for Disease Control and Prevention in Guangdong Province，Zhongshan 528403，China

【Abstract】 Objective To understand the contamination of Enterobacter sakazakii and the amount of pollution from 10 kinds of food，assess their risk，to provide the scientific basis for control and prevent infection，communication and prevalence of Enterobacter sakazakii.Methods The samples were tested in accordance with the national standard and real-time fluorescence PCR method.The samples were tested from 850 samples of 10 kinds of food.Standard strain was used as control.Results The 54 strains of Enterobacter sakazakii were detected，the detection rate was 6.4%.There was statistically significant difference in terms of 10 kinds of food.The order from high to low was：ice cream>chocolate nut>cooked meat>candy cake>bread，pastry>instant noodles>milk>water，condiment，raw meat.15 samples were contaminated volume over>30 MPN/100g(ml) concentration range，accounting for 27.7%（15/54）.Conclusion Enterobacter sakazakii were detected from 7 of 10 kinds of food.We should be targeted to strengthen supervision and management.

【Key words】 Enterobacter sakazakii； Qualitative； Quantitative

據WHO最新報告顯示，乳粉中的阪崎腸桿菌是導致嬰幼兒感染和死亡的主要原因之一。早在2002年國際食品微生物標準委員會就將阪崎腸桿菌列為對特定人群產生嚴重的生命危害、或產生慢性后遺癥的微生物，可見其危害［1］。然而，一項近期的研究結果表明，阪崎腸桿菌是一種廣泛存在的微生物，不僅能夠存在于污染的食品和食品工廠當中，而且在家居環境和幾乎所有的環境中均能夠分離得到［2］。為主動掌握阪崎腸桿菌的污染狀況及分布趨勢，本研究展開了對10類食品的摸底調查。該10類食品基本包括市面上銷售的主要食品，有國產的也有進口的，有本地的也有外地的，有生的也有熟的，有國家級省級名牌，也有本地區名優食品等。對公共衛生領域中的監管和預警，對推進社會的科學發展，弘揚本土的飲食文化，起著積極的作用。

1 材料與方法

1.1 樣品采集 兼顧到城區和鄉鎮、東南西北各方位，2010年7月~2010年12月樣品采抽于大型商場、超市、農貿市場、酒店、餐館、小吃店、快餐店、餅鋪、士多店等共20個區鎮328家銷售的10類食品，分別有奶類、糖餅類、面包蛋糕、熟肉制品、飲用水、調味品、方便面、生肉、冰淇淋、巧克力堅果等共850份。原則上要求同類食品品牌不重復，優先抽取本地產品、具地方特色產品和消費量較大的產品，包裝完整、保質期內。每份樣品抽雙份，一份為送檢樣，一份為留樣。

1.2 主要培養基與試劑 BPW、mLST-Vm 、DFI、TSA購于北京陸橋；阪崎腸桿菌實時熒光PCR檢測試劑盒購于深圳太太基因工程有限公司；氧化酶試劑購于廣州千江有限公司；G陰性板、ID肉湯購于美國BD，均在有效期內使用。

1.3 標準菌株 阪崎腸桿菌ATCC51329購于廣東環凱微生物科技有限公司。

1.4 檢測儀器 美國BD PHOENIX 100全自動細菌鑒定藥敏系統；美國OPTICON2實時熒光定量檢測儀；日本奧林巴斯BX51T-32H01系統顯微鏡。

1.5 方法 國標法、實時熒光PCR法同步進行，標準菌株作對照。

1.5.1 國標法 樣品處理按GB4789.40-2010《食品微生物學檢驗阪崎腸桿菌檢驗》進行。mLST-Vm肉湯培養液增菌后，挑取1環劃線于DFI顯色平板，（36±1）℃培養（24±2） h。挑取1～5個呈圓形、藍綠色，直徑為1～2mm的可疑菌落作革蘭氏染色、氧化酶試驗、生化鑒定(選用美國BD PHOENIX 100全自動細菌鑒定藥敏系統)，接種TSA平板觀察黃色色素，綜合菌落形態和生化特征報告檢測結果。定性檢出阪崎腸桿菌后作MPN值計數。

1.5.2 實時熒光PCR法 樣品處理按國標法進行。接mLST-Vm肉湯培養液增菌后，取1ml加到1.5ml無菌離心管中，8000rpm離心5min，棄上清液。加入50μl核酸溶解液，混勻后沸水浴5min，13000rpm離心5min，取上清液待檢。然后按試劑盒說明書操作，根據檢測樣品Ct值報告陽性或陰性結果。

2 結果

2.1 （1）奶類100份包括液態奶、奶飲品60份和奶粉、嬰幼兒米粉40份，其中有1份奶飲品和1份嬰幼兒米粉檢出阪崎腸桿菌。（2）糖餅類175份包括餅干酥角等110份、杏仁餅30份、糖果35份，依次檢出阪崎腸桿菌株數為1、12、1。（3）巧克力堅果80份包括巧克力50份、堅果30份，依次檢出阪崎腸桿菌株數為2、9。（4）方便面包括杯面、袋裝面40份，檢出阪崎腸桿菌2株。（5）冰淇淋30份（因抽檢時間安排在冬天，大部分商品已退出市場，抽檢件數稍小）檢出阪崎腸桿菌6株。（6）飲用水83份包括500ml等小瓶裝和18.9 L大桶裝，實時熒光PCR法2份陽性。（7）152份熟肉制品分5類：叉燒排骨、鹵肉、燒肉、燒雞鴨鵝、油雞切雞等檢出阪崎腸桿菌14株。（8）面包糕點類含速凍包子饅頭和即食糕點等80份，檢出阪崎腸桿菌5株。

2.2 生肉和調味品采用國標法、實時熒光PCR法均未檢出阪崎腸桿菌。

3 討論

3.1 阪崎腸桿菌（Enterobacter sakazakii)是人和動物腸道內寄生的革蘭氏陰性無芽胞桿菌，屬腸桿菌科腸桿菌屬，一直被稱為黃色陰溝桿菌（yellow pigmented enterobacter cloacae）。而陰溝桿菌則是食品衛生質量指標中大腸菌群的指示菌之一，阪崎腸桿菌的存在直接影響大腸菌群MPN值，本研究曾在檢出的54株阪崎腸桿菌中隨機抽取20株作大腸菌群測定，均顯示陽性結果。

3.2 阪崎腸桿菌對營養的要求不高，耐熱耐寒耐高溫，對清潔劑殺菌劑有較強的抵抗力，是一種普遍存在的微生物［3，4］。本研究數據顯示，10類食品當中有7類檢出阪崎腸桿菌，可見阪崎腸桿菌存在的廣泛性。其中冰淇淋、堅果、杏仁餅（地方特色食品）和熟肉檢出率較高，染菌量也較濃（見表2，表3），可能與加工制作過程或工藝流程有關，存在一定的致病風險，應引起警惕。

未檢出阪崎腸桿菌的3類食品分別是飲用水、調味品、生肉。（1）直接飲用水中存在該菌的數量甚少，83份水樣品國標法均未檢出，只有實時熒光PCR法2份陽性；（2）50份調味品包括醬油、醋、青芥辣、辣醬、復合調味料，具有酸、甜、苦、辣、咸等各種味道的特點，還含有各式各樣添加劑、防腐劑，酸堿度不同，不利于阪崎腸桿菌的生長；（3）60份生肉包括禽肉、畜肉、魚蝦貝類3種，在分離培養過程中發現有較多的干擾菌，分別檢出普通/彭氏變形桿菌16株、奇異變形桿菌1株、大腸埃希氏菌1株，共17株。這些干擾菌在分離平板上呈優勢生長，是否抑制了阪崎腸桿菌，有待進一步探討。

3.3 阪崎腸桿菌雖然廣泛存在于自然界，但食品中的染菌量一般不高。本研究定量結果發現，染菌量在30 MPN/100g(ml)濃度范圍以下的占72.3%（39/54），其中有7份樣品檢驗結果為＜0.3 MPN/100g(ml) (曾作重復試驗)，不同部位取材、分布不均，或污染量甚微所致。也就是說大多數食品中阪崎腸桿菌的存在量較少，分布又非常不均勻，檢驗時必須采用大量、均勻的樣品接種，才有可能覆蓋到該菌的污染。可見阪崎腸桿菌國標法MPN/值計數所規定的樣品用量333g(ml)，較其他致病菌25g(ml) 用量高的合理性。

3.4 兩種方法對比 實時熒光PCR法檢測時間短，靈敏度高，是初篩的好方法，而國標法則是報告結果的依據。本研究所采用實時熒光PCR法試劑盒的靈敏度為102-103copies/ml，國標法定性檢出限是每100g（ml）樣品檢出或未檢出阪崎腸桿菌。檢測結果是PCR法陽性率為7.4%（63/850），國標法檢出率為6.4 %（54/850）。即850份樣品中有841份國標法和實時熒光PCR法檢測結果一致，9份不同。日常工作中，也時而遇到實時熒光PCR法陽性而國標法未檢出的事例，如沙門氏菌、副溶血性弧菌、出血性大腸埃希氏菌O157等的檢驗都有所見。當國標法未檢出而PCR法陽性時應反復分離培養，以防漏檢。總之兩種方法同步使用可提高檢測結果的可靠性。

3.5 方法探討 （1）阪崎腸桿菌檢驗國標法全過程需要6d，增菌培養3d后如直接采用DFI平板上的純菌落（或再分純1d）作生化鑒定，可縮短1~2d檢測時間。也可同時接種TSA平板觀察黃色色素，即生化鑒定和色素觀察同時進行，兩不誤。（2）850份樣品按國標法進行分離培養，在操作過程中發現： DFI顯色平板上的阪崎腸桿菌菌落與多種干擾菌的菌落較為相似，均呈圓形、藍綠色、大小1～3mm。分別是普通/彭氏變形桿菌24株、肺炎克雷伯氏菌5株、非脫羧勒克氏菌3株、成團腸桿菌2株、奇異變形桿菌1株、大腸埃希氏菌1株、傷口埃希氏菌1株、日溝維腸桿菌1株、塞氏枸櫞酸桿菌1株，共39株，詳細見表1。通過劃線于TSA平板、生化鑒定、PCR法可以區分。（3）檢驗全過程關鍵控制點是培養溫度，分別有3種：36℃、44℃、25℃，須嚴格把關，否則直接影響檢驗結果。點滴體會僅供參考，希望能起拋磚引玉的作用。

本研究在檢出的54株阪崎腸桿菌菌株中隨機抽取16株（約1/3量）上送省級主管部門確證，結果反饋準確率達100%。

參考文獻

［1］魯曦，師寶忠，王彬等.LAMP法檢測乳粉中的阪崎腸桿菌.現代食品科技，2010，26(5)：540-543.

［2］Leclercq A，Wanegue C，Baylac P，et al.Comparison of Fecal Coliform Agar and Violet Red Bile Lactose Agar for Fecal Coliform Enumeration in Foods.Applied and Environmental Microbiology，2002，68(4)：1631-1638.

［3］張雪梅，孫鑫貴，盧陽等.阪崎腸桿菌的研究進展.中國乳品工業，2008，36（3）：42-46.

［4］梁鷹，王紅戟.阪崎腸桿菌研究進展.中國微生態學雜志，2008，20（4）：418-420.

（收稿日期：2011-04-06）

（本文編輯：梅宏偉）