三種支氣管肺泡灌洗液結核桿菌檢測方法在菌陰肺結核診斷中的應用研究

【摘要】 目的 探討涂片、培養、熒光定量PCR（FQ-PCR）檢測支氣管肺泡灌洗液（BALF）結核分枝桿菌對菌陰肺結核的診斷價值。方法 對73例菌陰肺結核患者的BALF行涂片、培養、FQ-PCR同步檢測。結果 菌陰肺結核患者的BALF涂片、培養、FQ-PCR檢查的陽性率分別為21.9%、34.2%和60.3%，FQ-PCR法敏感度高且假陽性低（占2.2%）。結論 BALF涂片和FQ-PCR檢測對菌陰肺結核的快速診斷具有重要的臨床應用價值，培養仍是目前診斷肺結核的金標準；三種方法結合使用可提高菌陰肺結核的診斷率。

【關鍵詞】 支氣管肺泡灌洗液； 熒光定量PCR； 菌陰肺結核

Study on three detection ways of bronchoalveolar lavage fluid TB bacilli in the application of smear-negative pulmonary tuberculosis diagnose ZHANG Yan.Yongzhou People's Hospital in Hunan Province，Yongzhou 425001，China

【Abstract】 Objective To explore the values of smearing，training and PCR in the detection of bronchoalveolar lavage fluid（BALF） lepae when diagnising smear-negative pulmonary tuberculosis.Methods Smearing， training and FQ-PCR on 76 cases of smear-negative pulmonary tuberculosis.Results The positive rate of balf smearing，training and the FQ-PCR were respectively 21.9%，34.2% and 60.3%.Way of FQ-PCR is sensitive and the 1 positive rate is low （2.2%）.Conclusion Ways of smearing and FQ-PCR have the significant clinical value when diagnosing the smear-negative pulmonary tuberculosis in the first time and smearing is still the best one.Therefore，the combination of the three ways can greatly improve the diagnosis of smear-negative pulomary tuberculosis.

【Key words】 BALF FQ-PCR Smear-negative pulmonary tuberculosis

結核菌分離培養是確診結核的“金標準”。菌陰肺結核（涂片、培養均陰性）約占全部肺結核的40%～60%^［1］，若其診斷缺乏“金標準”，易造成臨床誤診或漏診。本文通過對73例菌陰肺結核患者及45例非肺結核患者行支氣管鏡檢查留取支氣管肺泡灌洗液（BALF），采用涂片、培養、熒光定量PCR（FQ-PCR）檢測結核分支桿菌（MTB），探討三種方法對菌陰肺結核患者的臨床應用價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 研究對象均為2009年6月～2010年12月筆者所在醫院住院患者。初治菌陰肺結核患者73例，其中男43例，女30例，年齡16～73歲，平均（37.2±9.8）歲。病程1 d～3年不等。非結核患者45例，包括肺癌、支氣管擴張、大葉性肺炎、間質性肺炎。所有患者支氣管鏡檢查前痰涂片找抗酸桿菌≥3次陰性，1次培養陰性，臨床診斷為肺結核。

1.2 方法

1.2.1 標本的收集和處理 采用日本產OlympusBF-260型電子支氣管鏡，按支氣管鏡檢查技術常規進行術前準備。所有病例按病變部位選擇灌洗肺段，將纖維支氣管鏡頂端嚴密插入肺段或肺亞段支氣管開口處，先經活檢孔注入2%的利多卡因2～3 ml做灌洗肺段的局部麻醉， 然后注入37 ℃的生理鹽水5～10 ml，立即用專用的回收裝置吸引回收BALF， 可重復灌洗2～3次， 收集BALF約15 ml。

1.2.2 實驗室方法 對收集的BALF標本同時送檢以下3種檢測方法：（1）涂片找抗酸桿菌：按照中國防癆協會“結核病診斷實驗室檢驗規程”操作，用萋-尼氏染色抗酸染色法，≥3條抗酸桿菌/300視野為陽性。（2）結核菌培養：用BacT/Alert3D全自動分枝桿菌快速培養儀器系統（3D系統）進行臨床標本的分離培養。（3）應用熒光定量PCR（FQ-PCR）：檢測BALF結核分枝桿菌DNA，DNA基因拷貝數量＞1×10³拷貝/ml為陽性。

1.3 統計學處理 采用SPSS 10.0統計軟件包對數據進行處理，用卡方檢驗比較不同檢測方法診斷肺結核的陽性率。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

73例菌陰肺結核患者BALF分別用涂片、培養、FQ-PCR法檢查的結果見表1。

3 討論

肺結核患者由于化療、免疫功能障礙，結核桿菌的某些生物學特性發生變異，痰菌含量少或呈L型結核菌、肺部病灶局限未與引流支氣管相通等因素，均可致使痰涂片檢查陰性^［2］。支氣管鏡檢查作為一種輔助診斷肺結核的重要手段，可能獲得細菌學的依據，在臨床已廣泛開展。本研究中支氣管肺泡灌洗液直接取材于病灶處支氣管肺泡內，細菌濃度高，獲得結核分枝桿菌的機會增多^［3］，污染幾率低，且無痰患者也可以檢測。73例菌陰肺結核患者BALF涂片陽性率為21.9%，表明對于菌陰肺結核的實驗室診斷，抗酸染色涂片仍具有較好的實用價值。該組沖洗液培養結果陽性率為34.2%，反映出結核分枝桿菌培養這種傳統方法對于菌陰肺結核的陽性檢出率明顯高于涂片法（P＜0.05）。結核桿菌培養仍是目前診斷肺結核的金標準，尤其是進一步可行菌型鑒定和藥敏實驗，在指導臨床用藥等方面具有重要作用，這是其他方法無法比擬的。菌陰的患者，FQ-PCR 檢測可為陽性，本組FQ-PCR法檢測73例菌陰肺結核患者BALF中的TB-DNA， 陽性率為60.3%，顯著高于痰涂片陽性率及痰培養陽性率（P＜0.05）；而非肺結核組假陽性率只有2.2%，說明FQ-PCR法檢測特異性很高。表明FQ-PCR法能明顯提高痰涂片及培養陰性的肺結核患者的結核分枝桿菌檢出率，為菌陰肺結核的診斷提供依據。若涂片陽性，而FQ-PCR陰性，首先考慮為非結核分枝桿菌的感染，其次考慮操作原因導致PCR結果的假陰性^［4］。

涂片抗酸染色檢查是結核病實驗室最基本的細菌學檢查方法。其優點是簡便、快速和價廉；缺點是敏感性低、特異性差，無法辨別死菌與活菌。通常需5000～10000條菌/ml才能得到陽性結果，而且各種抗酸桿菌均可著色，需進一步試驗才可確定是否為結核分枝桿菌。細菌培養法的優點是靈敏度高于涂片，并可鑒定死菌與活菌，被譽為結核病診斷的黃金標準。其缺點是需時太久，通常4～8周才能獲得結果，快速培養也要2周，而且非結核分枝桿菌也可生長，需進行菌種鑒定方可確定是否為結核分枝桿菌^［5］。FQ-PCR技術把核酸擴增、雜交及光譜技術結合在一起，在封閉狀態下檢測，避免了常規PCR因污染而致的假陽性，利用特異性探針，實時檢測，與自動分析一體化，實現精確、特異、簡便、快速的檢測。FQ-PCR法能穩定檢測10copies結核桿菌基因組DNA， 靈敏度高。大量研究表明^{［4，6，7］}，活動性肺結核患者痰FQ-PCR檢測陽性率顯著高于痰涂片及培養。

本研究結果表明BALF涂片和熒光定量PCR檢測對菌陰肺結核的快速診斷具有重要的臨床應用價值，培養仍然是目前診斷肺結核的金標準，并可指導臨床用藥。三種方法在不同情況下結合使用可提高菌陰肺結核的診斷率。

參 考 文 獻

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（收稿日期：2011-04-08）

（本文編輯：梅宏偉）