恩度抗小鼠肝癌H22作用研究

【摘要】 目的 借助鼠模型觀察恩度應(yīng)用后腫瘤從開始生長(zhǎng)到長(zhǎng)到一定規(guī)模時(shí)腫瘤組織的生長(zhǎng)情況。方法 建立肝癌H22小鼠模型，共32只小鼠，隨機(jī)分為四組。在不同時(shí)間分別對(duì)各組給藥，分析實(shí)驗(yàn)第10、14、18天四組小鼠腫瘤體積情況。結(jié)果 實(shí)驗(yàn)第10天、第14天所有給藥組腫瘤體積與對(duì)照組腫瘤體積比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。實(shí)驗(yàn)第18天：接種腫瘤當(dāng)天開始腹腔給藥組（B組）腫瘤體積與對(duì)照組（D組）腫瘤體積比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。接種腫瘤前開始給藥組（A組）和接種腫瘤后開始給藥組（C組）腫瘤體積與對(duì)照組（D組）腫瘤體積比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論 單獨(dú)應(yīng)用恩度有抗腫瘤作用，接種腫瘤時(shí)為最佳給藥時(shí)機(jī)，而且需給藥18d才能體現(xiàn)恩度抗腫瘤作用。

【關(guān)鍵詞】 肝癌； 治療； 恩度； 小鼠； H22肝癌細(xì)胞株

血管內(nèi)皮抑素(Endostatin，ES)是膠原XⅧ在C端的一個(gè)水解片段，大小約20 kD，最初于1997年由O’Reilly等［1］在鼠成血管細(xì)胞瘤株培養(yǎng)液中分離提純得到的一種內(nèi)源性糖蛋白。ES通過抑制內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移以及誘導(dǎo)凋亡等機(jī)制來抑制腫瘤血管生成已得到大量研究的證實(shí)［2］。我國(guó)學(xué)者在血管內(nèi)皮抑素的結(jié)構(gòu)上增加了9個(gè)氨基酸，成功解決了重組人內(nèi)皮抑素復(fù)性難和穩(wěn)定性差的問題，成為我國(guó)第一個(gè)上市的血管生成抑制劑類抗腫瘤藥物(恩度)，在針對(duì)非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)的聯(lián)合化療臨床試驗(yàn)中顯示出良好的療效［3］，但對(duì)其他惡性腫瘤治療的效果鮮有報(bào)道。從基礎(chǔ)研究資料看，恩度的作用都指向抗血管生成，但作用于生成過程中的哪一個(gè)環(huán)節(jié)也未見報(bào)道，所以借助于鼠模型觀察恩度應(yīng)用后腫瘤從開始生長(zhǎng)到長(zhǎng)到一定規(guī)模時(shí)腫瘤組織的生長(zhǎng)情況，則能為下一步確定恩度的作用機(jī)制建立研究平臺(tái)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 病源 肝癌H22瘤株，由中國(guó)藥品制品鑒定所引進(jìn)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 4~5周昆明小鼠，雄性32只，平均體重19~22g/只，由山西省中醫(yī)研究所動(dòng)物室提供。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)環(huán)境 動(dòng)物室室溫22℃~24℃，相對(duì)濕度40%~45%，日光燈12h人工照明，專用鼠糧自由進(jìn)食，潔凈水自由飲用，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室為清潔級(jí)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 肝癌H22小鼠模型的建立 將冷凍保存在-80℃冰箱中的H22肝癌細(xì)胞復(fù)蘇后，注射入昆明小鼠左腋下，7日后，腫瘤生成明顯。在無菌條件下取腫瘤，以培養(yǎng)液調(diào)整其中瘤細(xì)胞密度至1×107個(gè)細(xì)胞/ml，用注射器吸取腫瘤懸液0.2ml注入32只4~5周齡的雄性昆明小鼠右腋下的皮下，并將32只小鼠隨機(jī)分為A、B、C、D四組，每組8只，建立動(dòng)物模型。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組 將32只小鼠按隨機(jī)分組方法，分成4組（A組、B組、C組、D組），每組8只。

1.2.3 各組用藥方法 A組開始給藥時(shí)間為實(shí)驗(yàn)第1天。實(shí)驗(yàn)第5天所有小鼠接種腫瘤。給藥方法：恩度3mg/kg注入腹腔，每日1次，直至小鼠被宰殺或小鼠死亡。A組：于實(shí)驗(yàn)第1天（接種腫瘤日前4d）開始給藥。B組：于實(shí)驗(yàn)第5天（接種腫瘤日）開始給藥。C組：于實(shí)驗(yàn)第9天（接種腫瘤日后第4天）開始給藥。D組：對(duì)照組，只造模。

1.3 小鼠腫瘤指標(biāo)測(cè)定 將接種后的昆明小鼠在清潔級(jí)動(dòng)物室內(nèi)飼養(yǎng)，每天觀察接種腫瘤生長(zhǎng)情況。觀察實(shí)驗(yàn)第10、14、18天各組小鼠的腫瘤體積。

1.3.1 小鼠體重 每日測(cè)量各小鼠體重，使用電子天平測(cè)定。

1.3.2 腫瘤大小 每日測(cè)量各小鼠左腋下腫瘤大小（使用游標(biāo)卡尺測(cè)定），計(jì)算腫瘤體積。腫瘤體積=長(zhǎng)徑×橫徑2/2。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0專用統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。使用單因素方差分析對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)果進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)和統(tǒng)計(jì)分析，進(jìn)一步采用LSD-t檢驗(yàn)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行多組間的兩兩比較分析與推斷。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

實(shí)驗(yàn)第10天、第14天所有給藥組腫瘤體積與對(duì)照組腫瘤體積比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。在實(shí)驗(yàn)第18天，接種腫瘤當(dāng)天開始給藥組（B組）腫瘤體積與對(duì)照組（D組）腫瘤體積比較，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），接種腫瘤前開始給藥組（A組）和接種腫瘤后開始給藥組（C組）腫瘤體積與對(duì)照組（D組）腫瘤體積差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

3 討論

腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移與血管的生成關(guān)系密切。腫瘤的生長(zhǎng)有兩個(gè)明顯不同的階段，即從無血管的緩慢生長(zhǎng)階段轉(zhuǎn)變?yōu)橛醒艿目焖僭鲋畴A段［4］，當(dāng)其直徑達(dá)到1~2mm后，若無新生血管生成以提供營(yíng)養(yǎng)，就不能繼續(xù)生長(zhǎng)。腫瘤血管形成機(jī)制又是極其復(fù)雜的，從某種意義上來講，是機(jī)體對(duì)腫瘤本身的血管形成機(jī)制和抑制血管形成機(jī)制的失衡造成的。

分子水平上，血管生成受兩大類因子調(diào)控，分別為促血管生成因子和血管生成抑制因子［5］。血管形成抑制因子有多種，目前對(duì)血管內(nèi)皮抑素的研究較為透澈，它是ⅩⅧ型膠原的一個(gè)片段，可與多種細(xì)胞表面蛋白作用，調(diào)節(jié)細(xì)胞的粘附和遷移。腫瘤停滯因子是Ⅳ型膠原的一個(gè)28000的片段，通過作用于整合素αVβ3達(dá)到抑制血管生成的作用。TSP-1是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的內(nèi)源性血管生成抑制因子，儲(chǔ)存于血小板的α顆粒，其作用受體為CD36［6］。IL-12可以通過下調(diào)VEGF及FGF的表達(dá)抑制荷瘤免疫缺陷鼠的腫瘤生長(zhǎng)［7］，此外，有證據(jù)表明提高血管內(nèi)皮抑素、腫瘤停滯因子等含量可以抑制腫瘤血管［8］。迄今為止，已發(fā)現(xiàn)很多血管抑制因子，并且已被臨床應(yīng)用。

目前流行的觀點(diǎn)是：腫瘤的血管形成是局部微循環(huán)中促血管生成因子和血管生成抑制因子之間的平衡發(fā)生偏斜的結(jié)果［9］。理論上講，任何一種可以恢復(fù)促血管生成因子和抑制血管生成因子平衡的治療都可引起血管的正常化。恩度是我國(guó)第一個(gè)上市的血管生成抑制劑類抗腫瘤藥物，本實(shí)驗(yàn)研究單獨(dú)應(yīng)用恩度是觀察其抗小鼠肝癌H22細(xì)胞株移植腫瘤的作用，并且選擇接種腫瘤前、接種腫瘤當(dāng)天、接種腫瘤之后3種開始給藥時(shí)間，動(dòng)態(tài)觀察恩度應(yīng)用后腫瘤生長(zhǎng)情況，希望通過本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)恩度抗腫瘤的最佳給藥時(shí)機(jī)，探索恩度與血管生成的相關(guān)性。結(jié)果表明實(shí)驗(yàn)第10天、第14天所有給藥組腫瘤體積與對(duì)照組腫瘤體積比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；在實(shí)驗(yàn)第18天，接種腫瘤當(dāng)天開始給藥組（B組）腫瘤體積與對(duì)照組（D組）腫瘤體積差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），而接種腫瘤前開始給藥組（A組）和接種腫瘤后開始給藥組（C組）腫瘤體積與對(duì)照組（D組）腫瘤體積沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。說明腹腔注射恩度有抗腫瘤作用，與之前的報(bào)道相符［1，2］；用藥時(shí)機(jī)和給藥時(shí)間體現(xiàn)恩度抗腫瘤效果。本實(shí)驗(yàn)提示，接種腫瘤當(dāng)日開始給藥且給藥時(shí)間達(dá)18d能體現(xiàn)恩度抗腫瘤作用；而接種腫瘤前和腫瘤開始生長(zhǎng)后給藥不能體現(xiàn)恩度抗腫瘤效果。由此可見，恩度有可能只作用于新生血管，提前給藥對(duì)腫瘤血管著床以及腫瘤血管生長(zhǎng)均無效，腫瘤生長(zhǎng)后給藥對(duì)腫瘤血管生長(zhǎng)也無效，其機(jī)制有待進(jìn)一步研究。為進(jìn)一步研究恩度的抗腫瘤血管機(jī)制可對(duì)本實(shí)驗(yàn)所留取腫瘤標(biāo)本進(jìn)行血管密度觀察，比較不同時(shí)間、不同組別小鼠腫瘤血管密度之間的差別。

綜上所述，接種腫瘤當(dāng)天開始腹腔注射恩度組（B組）小鼠腫瘤比單純?cè)炷＝M（D組）小鼠腫瘤小，接種腫瘤前、后開始給藥組小鼠腫瘤體積與空白對(duì)照組小鼠腫瘤體積無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。接種腫瘤當(dāng)天開始腹腔注射恩度有抗腫瘤作用，而且需給藥18d，具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。因此，隨著恩度抗腫瘤機(jī)制研究的進(jìn)一步深入，恩度有望成為癌癥治療的必不可少的重要藥物之一。

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（收稿日期：2011-04-06）

（本文編輯：梅宏偉）