六種植物器官提取液對(duì)兩種細(xì)菌的抑制活性

摘要 以大葉黃楊葉、蒼耳葉、蒼耳莖、蒼耳根、鵝絨掌葉、菝葜葉六種植物器官的提取物作為抑菌劑進(jìn)行抑茵實(shí)驗(yàn)。六種提取物對(duì)供試菌金黃色葡萄球菌和枯草桿菌均有不同程度的抑制作用，其中菝葜葉提取物抑茵作用最大，大葉黃楊葉、蒼耳莖的提取物也具有較強(qiáng)的抑茵作用，可望將其用于食品工業(yè)作為防腐劑和抑茵劑。

關(guān)鍵詞 植物提取液抑茵作用

中圖分類號(hào)Q-33 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼B

從植物中尋找天然活性物質(zhì)已成為食品工業(yè)作為防腐劑研制的主要途徑之一。目前，國外對(duì)植物源殺菌劑的研究較為深入，如virtanen等發(fā)現(xiàn)發(fā)芽后5-6d的黑麥實(shí)生苗提取物對(duì)雪腐鐮孢霉具有抗菌作用；Eberhora等研究表明黃連的提取物對(duì)馬鈴薯晚疫苗具有很強(qiáng)的抑制作用。國內(nèi)也對(duì)多種殺菌植物進(jìn)行了系統(tǒng)研究，成功開發(fā)了一些具有市場(chǎng)潛力的新型殺菌劑。如早期對(duì)天然大蒜素殺菌活性的研究及結(jié)構(gòu)的確定，成功開發(fā)出“抗菌素402”；吳恭謙的研究表明白頭翁的乙醇提取物對(duì)小麥赤霉病菌具有較高的抑制作用；林存鑾等人對(duì)37科90種植物對(duì)番茄花葉病毒(TMV)活性進(jìn)行篩選研究，發(fā)現(xiàn)小藜和玉簪2種植物提取液對(duì)TMV病毒有一定的治療作用。從最近的研究看，研究較為深入和成功的當(dāng)屬從銀杏中分離了多種抗菌活性物質(zhì)并通過人工模擬合成農(nóng)用殺菌劑。大量實(shí)驗(yàn)表明，該殺菌劑品種對(duì)蘋果炭疽病菌、玉米小斑病菌等多種病害有較為優(yōu)良的防治效果。

本研究選取了大葉黃楊葉、蒼耳葉、蒼耳莖、蒼耳根、鵝絨掌葉、菝葜葉等六種植物器官的丙酮提取物對(duì)2種細(xì)菌進(jìn)行了抑菌活性測(cè)定，以獲得有潛力的殺菌植物，為進(jìn)一步研究開發(fā)植物提取物提供素材和佐證。

1.材料和方法

1.1供試材料

菌種：金黃色葡萄球菌和枯草桿菌

供試植物樣品：稱取500 g處理過的植物樣品，移入潔凈干燥的三角瓶中，加入適量丙酮淹沒樣品，加塞，標(biāo)記，在室溫下連續(xù)浸冷三次(時(shí)間分別為24h、12 h、6 h)后，用布氏漏斗減壓真空抽濾，合并三次濾液，加入25 mL圓底燒瓶，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上進(jìn)行減壓濃縮至少量時(shí)轉(zhuǎn)入容量瓶中定容至10 mL，加塞封口備用。

1.2方法

1.2.1制作LB液體培養(yǎng)基

胰蛋白胨10g、酵母提取液5g、氯化鈉10g、蒸餾水1000mL

1.2.1.1培養(yǎng)基各種成分的性質(zhì)及用途

蛋白胨：蛋白胨是肉類、明膠等蛋白質(zhì)經(jīng)過酸或酶的水解產(chǎn)生的，其中主要成分是多肽和氨基酸。蛋白胨是多數(shù)微生物很好的氮素營養(yǎng)來源，但注意蛋白胨的成分和來源與制作方法有關(guān)。因此實(shí)驗(yàn)所用的蛋白胨不同，結(jié)果會(huì)有差異。蛋白胨中的色氨酸多半在制作過程中受到破壞，所以有些微生物的培養(yǎng)要在培養(yǎng)基中補(bǔ)充色氨酸。

酵母膏：酵母膏是酵母菌的水溶性自溶物經(jīng)過濃縮制成，是多種維生素最好的來源，加在培養(yǎng)基中對(duì)于有些微生物有刺激生長的作用。酵母膏含有18種氨基酸，含量最高的是谷氨酸，含量較多是天門冬氨酸、丙氨酸、賴氨酸、亮氨酸、異亮氨酸，酵母膏中碳水化合物的含量達(dá)82g/100g，礦物質(zhì)含量豐富，脂類含量較少。

1.2.2調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的酸堿度

1.2.2.1各種微生物對(duì)酸度的適應(yīng)范圍

微生物只能在一定的酸度范圍內(nèi)生長。由于真菌對(duì)酸的適應(yīng)范圍廣，并偏好微酸性的反應(yīng)，所以植物病理實(shí)驗(yàn)中常用的培養(yǎng)基往往是微酸性的，這對(duì)一般真菌生長是適宜的，不一定要調(diào)節(jié)酸度。本實(shí)驗(yàn)中LB培養(yǎng)基需要調(diào)到中性。

1.2.2.2培養(yǎng)基酸堿度調(diào)節(jié)方法

調(diào)節(jié)培養(yǎng)基PH到中性的方法如下：配成1mol/L的鹽酸和氫氧化鈉，用吸管從配成的1 L的培養(yǎng)基中吸取5 mL放人試管中，加溴百里酚藍(lán)指示劑5滴，如培養(yǎng)基呈黃色，則逐滴加入1 mol/L氫氧化鈉；如呈藍(lán)色，則逐滴加入1 mol/L鹽酸，使培養(yǎng)基最后呈草綠色。記下所加1 mol/L氫氧化鈉或鹽酸的量，所加的200倍即在1L培養(yǎng)基中應(yīng)加1 mol/L鹽酸或氫氧化鈉的量。

或者在未調(diào)pH前，先用精密pH試紙測(cè)量培養(yǎng)基的原始pH值，如果pH偏酸，用滴管向培養(yǎng)基中逐滴加入1 mol/L NaOH，邊加邊攪拌，并隨時(shí)用pH試紙測(cè)其pH，直至pH達(dá)7.6。反之，則用1 mol/L HCl進(jìn)行調(diào)節(jié)。注意pH值不要調(diào)過頭，以避免回調(diào)，否則，將會(huì)影響培養(yǎng)基內(nèi)各離子的濃度。

1.2.3培養(yǎng)基緩沖液的調(diào)節(jié)

培養(yǎng)基中的緩沖物質(zhì)可以防止已調(diào)好的pH值發(fā)生改變。緩沖物質(zhì)多，則緩沖容也就越大。LB培養(yǎng)液中有蛋白胨，除了提供養(yǎng)分以外，主要還有緩沖的作用，蛋白胨用量大，它的緩沖容也就越大，一般緩沖大的培養(yǎng)基，更適宜微生物的生長。

1.2.4滅菌

1.2.4.1高壓滅菌器的用法和注意事項(xiàng)

(1)檢查滅菌器中存在的水量。加水到指定的標(biāo)度；

(2)需要滅菌的器物放在滅菌鍋內(nèi)，將蓋緊密，打開氣門；

(3)加熱，空氣完全排除后關(guān)閉氣門；

(4)當(dāng)壓力上升到需要的指標(biāo)后，開始計(jì)算滅菌時(shí)間，滅菌過程中壓力保持不變；

(5)達(dá)到需滅菌時(shí)間停止加熱，稍微打開氣門排除蒸氣使壓力慢慢減慢；

(6)當(dāng)壓力降到內(nèi)外相等時(shí)，才能打開高壓滅菌鍋蓋。

1.2.4.2 LB液體培養(yǎng)滅菌

培養(yǎng)基滅菌一般都是加壓蒸氣(121℃ 20min)，蒸氣的壓力和處理的時(shí)間可以根據(jù)培養(yǎng)基的量和導(dǎo)熱性能增減，如果器皿所盛的量超過1000 mL，則需要延長時(shí)間。器皿中所盛培養(yǎng)基的量不能太多，否則滅菌不易完全，同時(shí)在滅菌后放氣時(shí)，培養(yǎng)基溫度下降要比器皿慢，如果放氣太快，培養(yǎng)基盛得太滿，則會(huì)因沸騰而粘濕棉花球。

1.2.5接種

在無菌操作臺(tái)內(nèi)將培養(yǎng)基倒入滅過菌的兩支試管內(nèi)，每支試管里L(fēng)B量約為試管的1/4。用接種環(huán)將兩個(gè)菌種接到LB培養(yǎng)基中。

1.2.6細(xì)菌培養(yǎng)

將兩支接種過細(xì)菌的試管放入37℃，叵溫箱中培養(yǎng)約12 h。

1.2.7多余培養(yǎng)基的保藏

多余LB培養(yǎng)基不應(yīng)扔掉，否則造成浪費(fèi)，應(yīng)該注明好培養(yǎng)基的種類和配制日期，否則會(huì)和實(shí)驗(yàn)室里眾多的培養(yǎng)基發(fā)生差錯(cuò)，第二次使用剩余培養(yǎng)基必須要無菌檢測(cè)。

1.2.8活性測(cè)定

參照Hiroyuki Haraguchi的方法，稍作修改，方法如下：12 h后在無菌操作臺(tái)內(nèi)分別取45 μL菌液，855 μL LB，60 μL提取物樣品，放人eppendorf試管，繼續(xù)放入37℃，恒溫箱中培養(yǎng)140 min。

1.2.9吸光度的檢測(cè)

將每個(gè)樣品分別放入比色皿中，再用分光光度計(jì)檢測(cè)樣品在600 nm波長下的吸光度值(A)。

2.試驗(yàn)結(jié)果

在600 nm波長條件下，測(cè)定樣品的吸光度，結(jié)果如表1。

3.分析討論

3.1 對(duì)植物樣品中有效成分的提取

一般有水浸法和有機(jī)溶劑萃取法，本實(shí)驗(yàn)選用丙酮作為提取溶劑，其原因如下：丙酮極性適中，對(duì)植物樣品中非極性成分與極性成分均能提出；沸點(diǎn)相對(duì)低，易揮發(fā)，利于濃縮、定容；丙酮本身對(duì)病原菌抑制作用較低，更能真實(shí)反映提取物的抑菌作用。

3.2 六種植物提取液對(duì)兩種細(xì)菌的抑制作用比較

培養(yǎng)基中添加抑菌物時(shí)，六種植物提取液對(duì)2種細(xì)菌均有不同程度的抑制作用，細(xì)菌從外觀上看表現(xiàn)為生長緩慢，菌數(shù)下降，在生理指標(biāo)上也有了較大的變化。從表1中可以看出，各種提取液的吸光度存在較大的差異，提取液抑菌作用越小，則溶液中細(xì)菌繁殖越多，溶液吸光度越大。如果提取物抑菌作用越大，則溶液中細(xì)菌越少，溶液吸光度越小。Hiroyuki等人的研究認(rèn)為吸光度小于0.03時(shí)，植物提取液活性很強(qiáng)，具有很強(qiáng)的抑菌效果；吸光度在0.03與0.1之間時(shí)，植物提取液活性較強(qiáng)，具有較強(qiáng)的抑菌效果；吸光度在0.1與0.5之間時(shí)，植物提取液的活性較弱，具有較弱的抑菌效果；吸光度大于0.5時(shí)提取液對(duì)細(xì)菌沒有抑制作用。參照其標(biāo)準(zhǔn)可認(rèn)為，本研究中菝葜葉提取液對(duì)金黃色葡萄球菌具有很強(qiáng)的抑制作用；蒼耳根提取液對(duì)枯草桿菌和蒼耳莖提取液、大葉黃楊葉提取液對(duì)金黃色葡萄球菌都具有較強(qiáng)的抑制作用；鵝絨掌葉提取液、蒼耳莖提取液、大葉黃楊葉提取液、蒼耳葉提取液、菝葜葉提取液對(duì)枯草桿菌和蒼耳根提取液、鵝絨掌葉提取液、蒼耳葉提取液對(duì)金黃色葡萄球菌都具有較弱的抑制作用；丙酮對(duì)兩種菌均沒有抑制作用。

不同植物、同一植物的不同器官的丙酮提取液對(duì)細(xì)菌的抑制效果是不同的。菝葜葉提取液對(duì)金黃色葡萄球菌抑制力最強(qiáng)，細(xì)菌生長差，這可能是菝葜葉提取液更易向細(xì)胞滲透，易于和膜蛋白相互結(jié)合，破壞蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)完整性，導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞膜的生理功能發(fā)生紊亂，因而受到影響。其次蒼耳葉提取液、蒼耳根提取液也具有較強(qiáng)的抑菌作用，且這些植物分布廣泛，資源豐富，值得進(jìn)一步研究開發(fā)。